[发明专利]应用pH敏感的比率荧光蛋白检测酶-前药反应的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种应用pH敏感的比率荧光蛋白检测酶-前药反应的方法。

背景技术

在现有的科学技术和医疗水平的条件下，人类治疗肿瘤的主要方法是化疗。化疗是利用抗肿瘤药物治疗肿瘤，临床应用始于上世纪40年代，随着肿瘤细胞动力学和临床药理学的发展，以及各种抗肿瘤药物的问世，加上采用联合化疗和成熟的化疗方案，有少数肿瘤可以治愈，如急性淋巴细胞白血病、何杰金病等。近十年来，国内外开始研究生物反应调节剂和诱导分化剂等类药物，与抗肿瘤药物有机配合，提高了疗效和减轻化疗药物的毒副反应，大大加速了肿瘤化疗学的发展。但这一疗法存在以下的缺陷：①肿瘤部位药物浓度不足；②系统毒性；③对肿瘤细胞缺乏高于正常细胞的敏感性；④出现耐药肿瘤细胞。这些缺陷使得肿瘤治疗无法彻底解决安全问题。

抗体导向酶-前药疗法(antibody-directed enzyme prodrug therapy，ADEPT)是将肿瘤相关单克隆抗体与激活前药的酶相连形成一种靶向肿瘤组织的抗体-酶复合物，然后给予前药，与定位在肿瘤表面的酶将前药活化为毒性药物，在肿瘤细胞中产生细胞毒性效应。酶-前药疗法克服了在肿瘤治疗过程中的肿瘤部位药物的低浓度和系统毒性的缺点，将酶的高效性与前药的低毒性相结合，开辟了肿瘤治疗的新领域。前药在设计过程中，是在原来肿瘤药物结构基础上添加基团，这些基团在反应过程中会存在pH的变化，因此，需要通过有效的途径来灵敏检测pH的变化过程。现有技术中，一般检测pH变化是应用pH计。但是，精密pH计检测pH变化时存在滞后的现象，在实时检测方面增加了难度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用pH敏感的比率荧光蛋白检测酶-前药反应的方法。

在本发明的第一方面，提供一种检测辣根过氧化物氧化酶(HRP)-吲哚-3-乙酸(IAA)反应中pH变化的方法，所述方法包括：

(1)在辣根过氧化物氧化酶(HRP)-吲哚-3-乙酸(IAA)反应体系中，加入pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins；

(2)根据pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins的荧光强度变化来确定反应过程中的pH变化。

在另一优选例中，所述的方法是体外方法。

在另一优选例中，所述的pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

在另一优选例中，步骤(2)中，利用荧光酶标仪测定不同时间点上，pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins在激发波长397nm/发射波长507nm的荧光强度值除以激发波长483nm/发射波长507nm的荧光强度值，获得的比值的前后变化代表了pH值发生变化。

在另一优选例中，还包括：将获得的比值与标准曲线进行比较；其中，所述的标准曲线通过将pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins置于已知pH值的缓冲液中，测定其在激发波长397nm/发射波长507nm的荧光强度值除以激发波长483nm/发射波长507nm的荧光强度值的比值；将该比值与相应的已知pH值作图获得。

在另一优选例中，所述反应体系中，pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins的终浓度是300±200μg/ml；较佳地是300±100μg/ml；较佳地是300±50μg/ml；更佳地是300±20μg/ml。

在另一优选例中，所述的pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins的制备方法包括：将SEQ ID NO:1所示的基因序列插入到pET15b载体中，转化大肠杆菌，诱导表达，破碎菌体，纯化获得pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins。

在另一优选例中，所述的反应体系中，反应介质是水(纯水)或缓冲液；较佳地是水(纯水)。

在本发明的另一方面，提供pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins的用途，用于检测辣根过氧化物氧化酶(HRP)-吲哚-3-乙酸(IAA)反应中pH变化。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、通过AKTA的咪唑浓度梯度洗脱模式纯化目的蛋白曲线图。蓝线：UV值；绿线：咪唑浓度增长值；A峰：上清液流穿柱子峰；B峰：目的蛋白洗脱峰。从图1得出目的蛋白pHluorins在咪唑浓度为120mM左右可以被洗脱。