[发明专利]应用pH敏感的比率荧光蛋白检测酶-前药反应的方法

权利要求书

1.一种检测辣根过氧化物氧化酶-吲哚-3-乙酸反应中pH变化的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)在辣根过氧化物氧化酶-吲哚-3-乙酸反应体系中，加入pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins；

(2)根据pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins的荧光强度变化来确定反应过程中的pH变化。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，利用荧光酶标仪测定不同时间点上，pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins在激发波长397nm/发射波长507nm的荧光强度值除以激发波长483nm/发射波长507nm的荧光强度值，获得的比值的前后变化代表了pH值发生变化。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括：将获得的比值与标准曲线进行比较；其中，

所述的标准曲线通过将pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins置于已知pH值的缓冲液中，测定其在激发波长397nm/发射波长507nm的荧光强度值除以激发波长483nm/发射波长507nm的荧光强度值的比值；将该比值与相应的已知pH值作图获得。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins的终浓度是300±200μg/ml；较佳地是300±100μg/ml；较佳地是300±50μg/ml；更佳地是300±20μg/ml。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins的制备方法包括：将SEQ ID NO:1所示的基因序列插入到pET15b载体中，转化大肠杆菌，诱导表达，破碎菌体，纯化获得pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应体系中，反应介质是水或缓冲液。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的反应介质是水。

9.pH敏感的比率荧光蛋白pHluorins的用途，其特征在于，用于检测氧化物氧化酶-吲哚-3-乙酸反应中pH变化。