[发明专利]一种敲除prcR基因的自杀质粒pYTRLRRT及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种自杀质粒及其构建方法。

背景技术

近年来研究中研究人员发现在某些G⁺菌QS体系中的AIP不仅仅是信号分子，它还具有抗菌能力，如乳酸乳球菌的nisin，植物乳杆菌的植物乳杆菌素等等。这些抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)的基因簇中除了含有ABC转运体编码基因外，还有一个辅助蛋白(accessory protein，AP)编码基因，它们的产物组成了AMP输出和处理体系。AMP的结构基因都位于其相应的免疫蛋白基因之前，产生的AMP大多数富含半胱氨酸，具有疏水性，而且，经研究发现，AMP的最大生产量与产生菌的非最佳生长条件有关。

根据AMP的性质不同，可将AMP分为两大类：一类是I型AMPs或硫醚抗生素，它们是一些对热稳定的肽类，在被分泌之前会被进行高度的翻译后修饰，如nisin、枯草菌素；另一类是II型AMPs或热稳定的AMPs，它们具有特征性的双甘氨酸基序，分泌之前不存在修饰过程，但在分泌后，前体肽的N端会有一个片段被移去，如植物乳杆菌素、乳酸杆菌素P等。

副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HD1.7，革兰氏阳性菌，2003年从齐齐哈尔丰源食品有限公司乳酸酸菜发酵液中分离获得。它最大的特点是在其发酵液中可产生抑制多种G⁺、G-和酿酒酵母生长的肽类物质，分子量在10kD左右，热稳定，酸性条件下(pH2～6)活性高，其性能比目前市面上常用的nisin更为优越，因为nisin能有效的抑制革兰氏阳性菌如一些腐败菌、致病菌和芽孢菌，而对革兰氏阴性菌起的作用并不大，甚至不起作用。同时经过研究还发现，当将高密度菌体发酵液(>10¹¹个/mL)添加到低密度菌体发酵液(<10⁵个/mL)中时，可促进低密度菌体中这种AMP的生成；发酵24h和48h的菌体发酵液，其抑菌能力相差较大。以上种种现象说明，该菌产生的这种AMP的产量可能受到菌群密度影响和控制。

国外Nakayama等通过PCR方法克隆到了副干酪乳杆菌拟群体效应相关基因(prcA、prcK和prcR)，但对于这些基因在群体感应中的具体功能，以及AMP产量是否与群体感应有关尚不明确。

目前，基因功能的研究方法主要有两种：一种是增强基因表达，然后对获得的表达产物进行研究；另一种是减弱或者终止基因表达，通过观察生物整体功能的变化，进而推测相应的基因功能。由于第一种方法往往不能反映基因产物的真实表达情况，而逐渐被抛弃。第二种方法中RNA干扰技术（RNAi）实际上只是在转录后水平上降低基因的表达，并不象基因敲除技术可以完全把基因从基因组中剔除掉，有时也会因背景的不干净导致产生的表型难以分析。因此，采用基因敲除技术成为了目前最为理想和合适的方法。

基因敲除技术根据基因打靶的目的不同，载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体。“响应面法优化Paracin1.7发酵条件及其产生菌遗传转化体系的初步建立”中记载了一种插入型载体，虽然该载体也成功的将抗性基因tet导入副干酪乳杆菌HD1.7细胞，但是抗性基因tet没有插入指定为点，并没有按照理论设计发生同源重组，没能敲除prcR基因。

发明内容

本发明为了解决现有自杀质粒没能成功敲除副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)HD1.7细胞中prcR基因的问题，而提供的一种敲除prcR基因的自杀质粒pYTRLRRT及其构建方法。

本发明敲除prcR基因的自杀质粒pYTRLRRT由prcR基因左侧片段prcRL、prcR基因右侧片段prcRR、四环素抗性基因和质粒pUC18构成；片段prcRL的核酸序列如SEQ ID NO：1所示；片段prcRR的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述敲除prcR基因的自杀质粒pYTRLRRT按以下步骤进行构建：