[发明专利]一种敲除prcR基因的自杀质粒pYTRLRRT及其构建方法

权利要求书

1.一种敲除prcR基因的自杀质粒pYTRLRRT，其特征在于敲除prcR基因的自杀质粒pYTRLRRT由prcR基因左侧片段prcRL、prcR基因右侧片段prcRR、四环素抗性基因和质粒pUC18构成；片段prcRL的核酸序列如SEQ ID NO：1所示；片段prcRR的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.上述敲除prcR基因的自杀质粒pYTRLRRT的构建方法，其特征在于敲除prcR基因的自杀质粒pYTRLRRT按以下步骤进行构建：

一、以L.paracasei HD1.7基因组DNA为模板PCR扩增prcR基因左侧片段prcRL，扩增片段prcRL的上游引物为prcRL-up，prcRL-up的核苷酸序列为5’-CCGGAGCTCCCTACTCAGCATTCAGAGGTCAACT-3’，扩增片段prcRL的下游引物为prcRL-down，prcRL-down的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCATCTTCAGCATCGTTTGGTGGTTGG-3’，PCR扩增片段prcRL的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的L.paracasei HD1.7基因组DNA、10μL浓度为1pmol/μL的prcRL-up、10μL浓度为1pmol/μL的prcRL-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增片段prcRL的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、61℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

二、用限制性内切酶Sac I及Kpn I对质粒pUC18和步骤一获得的片段prcRL分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μlprcRL双酶切片段、5μl质粒pUC18双酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，得到质粒pUC18-RL；

三、以L.paracasei HD1.7基因组DNA为模板PCR扩增prcR基因右侧片段prcRR，扩增片段prcRR的上游引物为prcRR-up，prcRR-up的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCGGTCAGCATTCGTAGAGTGTCGGCC-3’，扩增片段prcRR的下游引物为prcRR-down，prcRR-down的核苷酸序列为5’-CCGCTGCAGGCAGTGACCAGAGATAGCTCGGCGT-3’，PCR扩增片段prcRR的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的L.paracasei HD1.7基因组DNA、10μL浓度为1pmol/μL的prcRR-up、10μL浓度为1pmol/μL的prcRR-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增片段prcRR的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、69℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

四、用限制性内切酶PstI及Kpn I对质粒pUC18-RL和步骤三获得的片段prcRR分别进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl prcRR双酶切片段、5μl质粒pUC18-KL双酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，得到质粒pUC18-RLRR；

五、以pBR322质粒为模板PCR扩增四环素抗性基因Tet，扩增Tet的上游引物为Tet-up，Tet-up的核苷酸序列为5’-CCGGGTACCTCTCATGTTTGACAGCTT-3’，扩增Tet的下游引物为Tet-down，Tet-down的核苷酸序列为5’-GTCGGTACCTAATAGATATGTTCTGCCAAGGGT-3’，PCR扩增Tet的反应体系为50μL由10μL含Mg²⁺的5×PrimeSTAR Buffer、4μL浓度各为2.5mmol/L的dNTP Mixture、10μL浓度为25ng/μL的pBR322质粒、10μL浓度为1pmol/μL的Tet-up、10μL浓度为1pmol/μL的Tet-down、0.5μL浓度为2.5U/μL的PrimeSTAR HS DNA聚合酶和5.5μL灭菌ddH₂O组成；PCR扩增Tet的反应条件为98℃预变性3min，98℃变性10s、46℃退火15s、72℃延伸1.5min，共30个循环，再72℃延伸10min；

六、用限制性内切酶Kpn I对质粒pUC18-RLRR和步骤五获得的四环素抗性基因Tet分别进行酶切，然后用T4DNA连接酶连接双酶切片段，酶连体系为25μl由16.5μl四环素抗性基因Tet酶切片段、5μl质粒pUC18-RLRR酶切片段、2.5μl10×T4DNA Ligase Buffer和1μl浓度为3U/μL的T4DNA连接酶组成，16℃过夜连接，即得到敲除prcR基因的自杀质粒pYTRLRRT。