[发明专利]一种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及体外核酸检测领域，采用PCR结合焦磷酸测序技术，用于检测患者血液DNA中线粒体基因突变，具体涉及检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒。

背景技术

线粒体12SrRNA基因是氨基糖苷类抗生素导致的非综合征型听力损失的一个突变热点区域。由于A1555G和C1494T突变在12SrRNA基因形成G-C和U-A配对使得与氨基糖苷类抗生素的结合更加容易，这就是为何携带这些突变的人在接触了氨基糖苷类抗生素时会出现或加重耳聋的原因。因此对这两个点突变的检测，对于预防氨基糖苷类抗生素中毒性耳聋有着重要的临床意义。目前关于线粒体耳聋基因的检测方法有多种，文献已报道的方法有：酶切法、直接测序法、基因芯片法、实时荧光定量Taqman探针法等。检测的突变热点主要是1555、1494、961等。

目前这些方法只能定性检测是否有基因突变，而且只能检测出突变细胞比率在10%-20%以上的外周血，相比于传统测序等方法，焦磷酸测序灵敏度更高，成本更低，不仅可以定性检测是否有基因突变，而且可以获得突变的比例。

焦磷酸测序技术是一种基于聚合原理的DNA测序方法，是新一代DNA序列分析技术。它是有4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由Pyrogram 转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。通过分析出峰情况，达到测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。

目前市场上还没有利用焦磷酸测序技术进行线粒体基因突变检测的产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒，是具有特异性高、成本低、定量、准确检测线粒体基因突变的试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒包括含有SEQ ID NO.1所示的正向扩增引物、SEQ ID NO.2所示的反向扩增引物的PCR反应液，SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的测序引物1和测序引物2。

正向扩增引物SEQ ID NO.1：5’-GGCCCTGAAGCGCGTACACA-3’（mtDNA nt1463-1482）。

反向扩增引物SEQ ID NO.2：5’-biotin-TGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3’ (mtDNA nt1673-1692)。

测序引物1 SEQ ID NO.3：5’-GCCCTGAAGCGCGTACACAC-3’ （mtDNA nt1464-1483）。

测序引物2 SEQ ID NO.4：5’-TACGCATTTATATAGAGGAG-3’ （mtDNA nt1535-1554）。

所述试剂盒中含有空白对照品，所述空白对照品为水。

试剂盒含有A1555G与C1494T突变的阳性对照品。

测序引物1的序列与正向扩增引物SEQ ID NO.1相同。

所述的PCR反应液中其他组分为常规的10×PCR Buffer、dNTPs和H₂O，各组分按常规体积比配制：10×PCR Buffer、dNTPs和H₂O和反应液中引物的体积比为5∶3∶36∶1。

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，其中包含有DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，由5’-磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶，Taq聚合酶。

其中，反向扩增引物SEQ ID NO.2的5’端进行生物素标记。正向扩增引物SEQ ID NO.1在纯度较好的情况下，也可以替代测序引物1使用。

本发明的优点及有益效果：

本发明提供的一种检测线粒体基因突变的焦磷酸测序试剂盒，定性、定量准确，具有灵敏度高、特异性强的优点，样品处理简单，测序速度快，高通量，半个小时完成一次上机反应，直接给出检测位点的频率分析，结果直观。