[发明专利]导入hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库

权利要求书

1.一种用于医学领域的导入hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其主要特征是以内切酶EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo，以Ligation Mix连接经PCR扩增、凝胶电泳分离的hTERT和pLXSNneo酶切产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，转化DH5a感受态细胞以纯化扩增并挑取耐氨苄青霉素菌落抽提质粒，以脂质体转染离体传代呈对数生长的巨核细胞，使重组子与细胞的DNA整合，并扩大培养经G418筛选含阳性重组子细胞，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达、免疫组化、细胞增殖周期及其凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为hTERT介导体外研究巨核细胞模型冻存于液氮，为从细胞水平(替代人体或动物直接试验)在体外长期研究其病理机制提供细胞模型和细胞库。

2.根据权利要求1所述的导入hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其特征是所指细胞模型为(1)巨核细胞转染了hTERT基因而成为可长期传代培养的永生化巨核细胞模型；(2)巨核细胞模型的染色体核型为二倍体“46，XX”或“46，XY”；(3)巨核细胞模型的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepato ZYME-SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(4)巨核细胞模型不能在软琼脂内生长(形成克隆)；(5)为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)巨核细胞模型的DNA中整合了hTERT基因，表达hTERT基因的mRNA产物；(7)体外连续培养10-11周(第85代)仍处于对数生长期；(8)能反复冻存、长期传代培养；(9)用于研究巨核细胞的功能；(10)可再生性地保存巨核细胞相关的遗传资源。

3.根据权利要求1所述的导入hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其特征是取自因其他实验所需而采集的、并在其他实验后多余、废弃的巨核细胞构建之。

4.根据权利要求1所述的导入hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其特征是所用的培养液为含有20％胎牛血清、5～10nmol／L胰岛素的RPMI1640或含有20mL／L胎牛血清、5～10nmol／L胰岛素的低糖DMEM培养液。

5.根据权利要求1所述的导入hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其特征是用作脂质体转染法导入重组子的巨核细胞，处于预培养后1-2天。

6.根据权利要求1所述的导入hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其特征是作染色体核型分析时，每5mL培养液中加入250ug／ml秋水仙素100ul，混匀后置37℃培养箱4小时。

7.根据权利要求1所述的导入hTERT重组子构建巨核细胞模型及其细胞库的方法，其特征是细胞库的构建包括(1)筛选经鉴定后符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近的hTERT重组子转导的巨核细胞；(2)作传代、扩大培养，取生长状态良好、处于对数生长期的不同世代的贴壁细胞；(3)经消化、终止、离心(1200r／min，6min)步骤收获细胞；(4)用含二甲亚砜的冻存液配制密度为5×10⁵个／ml的细胞悬液；(5)按照4℃，0.5h；-20℃，2h；-70℃，过夜；入-196℃液氮的程序冻存细胞；(6)可再生性地长期保存hTERT重组子转导的巨核细胞模型，备作遗传资源和科研材料。