[发明专利]一种采用低渗透压收获液收获病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种采用低渗透压收获液裂解细胞使病毒释放并使其得到有效收获的工艺方法。

背景技术

水痘-带状疱疹病毒（Varicella-Zoster virus，VZV）属α疱疹病毒亚科，为双链DNA病毒，其原发感染为水痘，潜伏感染再激活时可引发带状疱疹。接种疫苗是预防由VZV引起的水痘与带状疱疹的最有效措施。迄今为止，水痘减毒活疫苗（Oka株）是唯一获准用于预防由VZV引起的疾病的疫苗。接种疫苗是公认的预防由VZV引起的水痘的最有效措施。

轮状病毒(Rotavirus，RV)是引起婴幼儿严重腹泻和脱水的主要病因，在发展中国家和发达国家都是一个重要的公共卫生问题，全世界<5岁的儿童每年大约有600,000左右的死亡病例，85%的死亡儿童在发展中国家。轮状病毒腹泻不但造成社会的疾病负担，而且带来了巨大的经济损失。疫苗免疫是唯一可行的预防轮状病毒腹泻较高发病率和死亡率的方法。有鉴于此，世界卫生组织在1997年将轮状病毒疫苗的开发列为全球新疫苗研制开发的第一项目，世界各国的有关机构都在积极进行轮状病毒疫苗的研制工作。

EV71病毒和CA16病毒均为引起婴幼儿手足口病的主要病原体。人肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科,基因组为单股正链RNA,长度约为7400个核苷酸,仅含有一个开放读码框,编码的多聚蛋白约含2190个氨基酸。该病毒最早于1969～1970年间在美国加利福尼亚州发生中枢神经系统症状的婴儿粪便中分离得到。电镜观察发现该病毒的形态及理化特性都与当时已知的其他肠道病毒类似,但中和抗体试验和免疫扩散试验却未发现交互作用,因此认为是一种新型肠道病毒,命名为人肠道病毒71型。

柯萨奇病毒A组16型（简称：CA16）于1958年被分离出，CA16是单正链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，为二十面体立体对称，无包膜。基因组长约7 400bp,包括5′及3′端的非编码区和中间一个大的开放读码框(ORF),依次由VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 11个基因组成,主要编码产生病毒结构蛋白。在历次手足口病的流行中,EV71与CA16交替或共同出现,成为HFMD的主要病原体。

甲型病毒性肝炎简称甲型肝炎，是由甲型肝炎病毒(甲肝病毒)引起的一种急性传染病，粪-口传播是其主要传播途径。甲型肝炎病毒属于微小核糖核酸病毒科，肝病毒属。病毒颗粒呈球形，直径约为27nm，无囊膜，衣壳由32个壳粒组成，呈20面体立体对称，每个壳粒具有四个多肽分别为病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，基因组为单股正链RNA，其长度相当于7500个核苷酸左右。在RNA的3′末端有多聚的腺苷序列，在5′末端以共价形式与病毒基因组蛋白。根据病毒核苷酸序列分析，人甲肝病毒可以分为四个基因型，但其抗原性相似，所以甲型肝炎病毒只有一个血清型。

病毒疫苗的制备一般是先将毒种接种于未感染的适宜代次的细胞上进行传代，当达到一定程度细胞病变时收获感染细胞，加适量疫苗液制成原液。原液经冻融，超声破碎，离心，过滤澄清，得到上清液，加入疫苗稳定剂即半成品；半成品冻干或直接分装后即成为冻干疫苗或液体剂型疫苗。

自1974年Oka株水痘减毒活疫苗问世以来，欧美等国家陆续开始了水痘疫苗的生产，其生产工艺均采用克氏瓶静止培养，生产规模和病毒产量受到一定的限制。轮状病毒的大规模培养主要采用转瓶或细胞工厂，EV71、CA16病毒和甲肝病毒的大规模培养主要采用细胞工厂，上述病毒均属于胞内病毒，在病毒的收获工艺中需要有效的破碎裂解细胞使病毒释放，并保证病毒颗粒的完整性。而不同的收获工艺对细胞的裂解程度和病毒颗粒的完整性的影响不同。收获方式直接影响病毒滴度值，而病毒收获液的有效高滴度值是影响疫苗品质的重要因素。因此，选择一种合适、有效的病毒收获方式至关重要。

水痘病毒、轮状病毒、EV71病毒、CA16病毒和甲肝病毒均属于细胞内病毒，具有很强的细胞结合活性，病毒收获时必须收集并破碎细胞才能得到游离的病毒颗粒。目前针对上述病毒的上市产品中，各厂家多采用冻融法收集和破碎细胞，该方法适合于转瓶和克式瓶等培养方式，但不适用于细胞工厂培养系统；也有厂家采用含EDTA或胰蛋白酶的消化液经消化收集细胞，并采用冻融法破碎细胞，该方法适用于细胞工厂培养系统，但存在引入消化液成份并难以去除的弊端，对疫苗的安全性存在风险。