[发明专利]一种检测志贺氏菌的核酸侧向流试纸条的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及食品及加工原料中福氏志贺氏菌的核酸扩增产物侧向流免疫胶体金试纸条试剂盒的制备和应用方法。 

背景技术

为有效控制食品生产和进出口贸易中因致病性微生物引起的食源性疾病，保证食品领域的公共安全，需要开发灵敏、便捷、准确的食源性病原微生物检测方法。在食源性疾病危险因素中，在我国流行的食源性疾病中，微生物性食物中毒位居第一，而在食源性病原微生物中其中最典型的致病菌是志贺氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7等病原菌。志贺氏菌是革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界或寄生于人体及动物体表和体内，金黄色葡萄球菌的致病力强，常可引起皮肤、组织和器官的炎症，产生的肠毒素可污染食物导致食物中毒。 

传统的食品生产、质量监督和进出口检验检疫中，常规的细菌培养及鉴定方法，检验步骤繁琐，检验周期长，对有些细菌无法给出快速和准确的鉴定，不能完全满足质量控制及进出口检验检疫的要求。基于核酸扩增的方法检测对象是来自病原微生物的DNA，经特异性扩增后进行产物鉴定，这类方法因灵敏度高，特异性好，耗时少而发展迅速，主要的方法包括普通/荧光PCR和核酸环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)（发明专利：快速检测志贺氏菌的LAMP试剂盒，公开号：CN102851382）方法。常规PCR需电泳检测，费事较长，对PCR产物进行非电泳分析方法的还包括将PCR产物进行变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）的发明专利“饲料中沙门氏菌和志贺氏菌检测试剂盒及其检测方法”（公开号：CN101624624A）及焦磷酸测序分析的检测方法（“一种食源性致病菌的快速鉴定方法”，公开号： CN101875967A）。荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性，具有实时性和准确性等特点，特别是依赖探针结合的TaqMan方法，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。已有多个专利提供了不同的检测方法，并且从单一菌种检测的方法（发明专利“志贺氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒”，公开号： CN101153326了“采用荧光定量PCR技术检测常见致病菌的寡核苷酸引物及其检测常见致病菌的方法和用途“，公开号:CN101928773）向多菌种复检发展，如公开号为CN102260740的发明专利”沙门氏菌/志贺氏菌双重荧光PCR检测试剂盒”， 公开号为CN102206703的发明专利“三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒”以及“四重荧光定量PCR检测试剂盒及用途”（公开号：CN102212618）分别提供了两重、三重及四重荧光PCR检测方法。更高通量的检测方法包括了悬浮芯片和膜/玻片基因芯片方法，如公开号为CN101440404的发明专利“一种应用悬浮芯片技术检测宋内志贺氏菌方法”、公开号为CN102827795的专利“基因基于基因芯片的水体中13种病原微生物同步快速检测方法”及发明专利“用于检测水产品中重要致病菌的基因芯片及其试剂盒”（CN102311993）分别提供了悬浮和固相芯片检测方法。实时定量PCR和芯片检测对设备依赖性强，难以实现现场检测。 

  

另一类检测方法是基于双抗体夹心的免疫学检测方法，其检测对象主要是蛋白质分子，竞争法检测的对象为小分子化合物和半抗原分子，这两种免疫学检测方法都可以用免疫胶体金试纸条的方法实现，是快速检测的常规方法，具有快速、简单、成本低廉的优点，公开号为CN102135537的发明专利“志贺氏菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法”即是此类方法。过去病原微生物的免疫学检测主要依据上述抗原与抗体的结合反应，用酶联免疫吸附（ELISA）方法或免疫胶体金胶体金试纸条或完成检测。在免疫胶体金检测中，利用抗原和抗体的特异性结合的特点，形成抗原一抗体一有色颗粒复合物而富集在包被线上，形成肉眼可见的有色沉淀线，对蛋白的检测依赖高亲和力和高特异性抗体的获得，在病原物分析时因为基因编码的规律和简并规则，DNA较蛋白质更易于产生序列差异，这种差异也更易于准确检出，通过将免疫学检测的方法移植于核酸产物检测可以有效提高核酸产物的检测效率，通过在PCR扩增引物中引入特殊的标记物就可以实现双链产物的免疫学检测。