[发明专利]犬细小病毒病毒样颗粒、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域、基因工程领域及兽医生物制药领域，具体地说，涉及犬细小病毒病毒样颗粒、其制备方法及应用。

背景技术

1978年，澳大利亚人Kelly和加拿大人Thomson等从患出血肠炎的病犬中分离到犬细小病毒病原，为了与犬极细小病毒区别，将此分离出的病原命名为CPV-2。1979年和1984年，又有两种犬细小病毒的亚型CPV-2a、CPV-2b相继出现并取代CPV-2，在全球范围内广泛流行。2002年出现关于CPV-2c的报道。CPV感染犬科动物，具有高度接触传染性，主要引起出血性腹泻和心肌炎，幼犬中发病率和死亡率都很高。该病已成为犬科动物的一种重要传染病，给经济动物养殖业造成极大的危害。

犬细小病毒属于细小病毒科细小病毒属成员，病毒外观呈六角形，无囊膜，二十面体等轴对称，直径约为20nm，衣壳由32个壳粒组成。该病毒血凝特性较强，能够凝集猪和恒河猴的红细胞。CPV基因组长约5.2kb，包括两个开放阅读框，分别编码非结构蛋白和结构蛋白。其中病毒结构蛋白VP1和VP2由相同的mRNA通过选择性剪接后翻译而来，VP1包括VP2蛋白的全部序列，VP2是病毒衣壳的主要组成蛋白，并决定病毒的主要生物学特性。

目前用于犬细小病毒的疫苗主要是弱毒疫苗和灭活疫苗，但各自存在缺点，例如，弱毒疫苗存在毒力返祖及重组的危险，灭活疫苗免疫原性较弱，且不能引起细胞免疫应答等。因此，研制新型的CPV疫苗成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种犬细小病毒病毒样颗粒、其制备方法及应用。

本发明的另一目的是提供一种犬细小病毒性肠炎疫苗、其制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来生产犬细小病毒病毒样颗粒。

本发明首先提供一种优化的犬细小病毒VP2基因，即根据昆虫细胞偏爱密码子对犬细小病毒VP2基因进行优化，得到优化的犬细小病毒VP2基因。优化前犬细小病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，优化后的犬细小病毒VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。优化后的VP2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供一种犬细小病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：（1）重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将前述优化的VP2基因插入到昆虫细胞表达载体pFastBac1中，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒；（2）重组杆状病毒的拯救：用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒；（3）犬细小病毒病毒样颗粒的制备：将获得的重组杆状病毒按MOI=0.1接种昆虫细胞，4-5天后收获上清，即得犬细小病毒病毒样颗粒。

前述方法中，步骤（2）-（3）中使用的昆虫细胞为Sf9细胞。

步骤（2）中待Sf9细胞的细胞汇合度达到80%以上时进行转染。本发明还提供由上述方法制备的犬细小病毒病毒样颗粒。

本发明还提供所述犬细小病毒病毒样颗粒在制备犬细小病毒性肠炎疫苗中的应用。

本发明还提供一种犬细小病毒性肠炎疫苗，其是将上述制备的犬细小病毒病毒样颗粒辅以防腐剂和佐剂制备而成。其中，所述防腐剂为叠氮钠等，优选终浓度为0.01%；所述佐剂为磷酸铝等，优选终浓度为0.4%。

本发明的犬细小病毒性肠炎疫苗为肌肉注射疫苗或口服疫苗。

本发明进一步提供上述制备的犬细小病毒性肠炎疫苗在预防犬/猫科动物细小病毒性肠炎中的应用。

本发明利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来生产犬细小病毒病毒样颗粒，以杆状病毒作为表达载体，以Sf9细胞作为生物反应器，制备的犬细小病毒性肠炎疫苗具有产量高、生产成本低、免疫原性高、安全性好、便于大规模生产等优点，对犬细小病毒性肠炎具有良好的免疫及预防效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中重组杆状病毒表达质粒Bac-VP2的构建示意图。

图2为本发明实施例1中重组表达质粒Bac-VP2转染Sf9昆虫细胞后的情况；其中，A为正常细胞对照组，B为重组表达质粒转染细胞组。

图3为本发明实施例1中重组杆状病毒感染细胞上清的电镜检测结果。

图4为本发明实施例1中重组杆状病毒感染Sf9细胞后间接免疫荧光检测结果；其中，A为重组杆状病毒感染组，B为正常细胞组。

图5为本发明实施例2中犬细小病毒性肠炎疫苗免疫豚鼠后机体内血凝抑制抗体效价。