[发明专利]一株放线菌波卓链霉菌及其应用

权利要求书

1.一株放线菌菌株波卓链霉菌（Streptomyces bottropensis），其特征在于：其保藏编号为：CGMCC.6993。

2.权利要求1所述的波卓链霉菌在生产磷脂酶D中的应用。

3.一种制备磷脂酶D的方法，其特征在于， 

(1)  菌株的活化

用竹签将筛选出的高产菌株从原始斜面接种到新鲜高氏一号固体斜面培养基，于20~32℃培养箱中静置培养3~14d；

(2) 摇瓶种子的制备

   用接种铲从固体斜面铲取约0.1~5cm²菌苔到种子培养基，于自动旋转摇瓶机上，温度20~32℃、转速50~300 rpm，培养16~72 h；

(3) 摇瓶或5L发酵罐发酵液的制备

   摇瓶微生物发酵：将种子以3~15% 接种量转种，于自动旋转摇瓶机上，温度20~32℃、转速50~300 rpm，培养48~144 h；

   发酵罐微生物发酵：将种子以3~15 %接种量转种，于5L发酵罐上，温度20~32℃，搅拌转速50~300 rpm，通气比0.5~2 vvm，培养24~120 h；

(4) 发酵液的后处理

   将上述发酵液于超声破碎仪进行细胞破碎，超3s，停5s，总时长1~20 min，之后离心，即获得含有磷脂酶D的上清液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的高氏一号固体斜面培养基为: 100mL中含 Nacl 0.05g，KNO₃ 0.1g，K₂HPO₄   0.05g，FeSO₄ 0.001g，MgSO₄·7H₂0 0.05g，琼脂粉2g ，pH:7.0， 121℃灭菌30min；

所使用的种子培养基为：100mL中含葡萄糖1g，黄豆饼粉1g，蛋白栋0.3g， NaCl 0.25g，CaCO₃ 0.2g ，pH 7.0，121℃灭菌30min；

所使用的发酵培养基为：100mL中含葡萄糖1g，黄豆饼粉1g，蛋白胨0.3g， NaCl 0.25g，CaCO₃ 0.2g ，pH 7.0，121℃灭菌30min。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，固体斜面培养基还添加一定比例的无机盐 ，选自硝酸钾、MgSO₄·7H₂O、硫酸铵、硫酸锌、氯化钠、碳酸钙、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾。

6.权利要求1所述的波卓链霉菌在合成磷脂酰丝氨酸中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，波卓链霉菌发酵分泌产生磷脂酶D，菌株发酵液经超声破碎、离心获得的上清液作为磷脂酶D粗酶液，以大豆磷脂酰胆碱和L-丝氨酸为原料合成磷脂酰丝氨酸。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：检测粗酶液中磷脂酶D活性的方法为：大豆来源的磷脂酰胆碱溶于1~50 mg/mL有机相氯仿中，水相由菌株发酵粗酶液与1~500 mg/mL的 L-丝氨酸，体积比0.1~5 %的L-丝氨酸，0.1~200 mM CaCl₂ 混合而成，有机相与水相1:1震荡混合，保温1~10 h，提取有机相HPLC检测磷脂酰丝氨酸的含量。