[发明专利]肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于医学领域，是一种检测与肝衰竭预后相关基因甲基化程度的检测法及试剂盒，尤其是一种定量检测谷胱甘肽S-转移酶M3启动子甲基化程度的检测法和试剂盒。 

背景技术

慢加急性肝衰竭（ACHBLF）是以黄疸、凝血功能障碍、肝性脑病及腹水等为主要表现的一组临床症候群。它发生在慢性肝病的基础上，是由多种因素引起的大面积肝细胞坏死或严重肝损害，导致肝脏合成、排泄、生物转化与解毒等功能发生严重障碍或失代偿。慢加急性肝衰竭可由多种原因诱发，在我国其主要病因是慢性乙型肝炎(CHB)。乙型肝炎重症化由多基因、多因素所致，其发病机制非常复杂。目前研究表明，重症乙型肝炎的发生和发展主要由病毒和宿主两大因素相互作用所致。同时，乙醇、药物、化学毒物、生物毒物、乙肝病毒（HBV）耐药变异、免疫抑制剂及合并感染等因素也被证实能够导致慢性HBV感染者的急性发病，表现为慢加急性肝功能衰竭，称为慢加急性重型乙型病毒性肝炎（ACHBLF）。该疾病病情凶险，进展迅速，国内外报告的病死率高达60%-80%，预后差，且临床上并无有效评估病情、判断疗效和预测预后的体系，其临床救治仍是医学难题。因此，揭示乙型肝炎重症化的机制，建立有效的综合评估预后体系，制订有效的防治手段具有重大意义。 

研究表明，表观遗传在慢性HBV感染的重症化过程中发挥重要作用，已逐渐成为医学领域的研究热点。其研究范畴主要包括脱氧核糖核酸（DNA）甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA调控。其中，DNA甲基化是表观遗传学的重要调控机制之一，它是在DNA甲基转移酶（DNMT）的作用下，将S-腺苷甲硫氨酸中的甲基转移至胞嘧啶的5-碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。在人类基因组中，CpG序列出现率仅1%，但在某些区域存在鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成CpG岛。而甲基化则主要发生于CpG岛的胞嘧啶上。CpG岛的甲基化可使基因沉默、失活，影响基因转录，调控基因表达，而非甲基化则与基因活化密切相关。研究证实，感染HBV的宿主均存在DNMT表达上调的现象，因此，HBV可通过增强DNMT的活性，促使病毒DNA启动子发生甲基化，抑制病毒DNA转录，从而抑制病毒的复制。 

肝衰竭患者体内存在不同程度的氧化损伤。氧化损伤在肝衰竭的发生发展过程中发挥重要作用。谷胱甘肽S-转移酶（GST）是主要存在于肝细胞内的Ⅱ相代谢酶，可促进谷胱甘肽与毒性代谢产物结合，清除细胞内自由基，可使有害的亲电物质与谷胱甘肽结合，将其排出体外，从而发挥保护机体核酸和蛋白质的功能。GST超家族主要有4个亚家族—α、μ、π、θ，分别为GSTA、GSTM、GSTP、GSTT。其中，谷胱甘肽S-转移酶M3（GSTM3）是μ亚家族的重要成员之一，它在与环境致癌物质的结合与脱毒过程中作用巨大，同时也具有极强的抗氧化能力。研究表明，GSTM3基因甲基化程度与其表达水平间存在明显的负相关。GSTM3基因启动子的高甲基化可以使GSTM3表达减低，进而导致机体抗氧化能力减低，氧化损伤加重，正常的肝功能受损。甲基化特异性聚合酶链反应（MSP-PCR）法是目前应用最为广泛的DNA甲基化检测方法，具有较强的特异性、敏感性和可操作性。但是MSP-PCR只能作定性研究且其聚合酶链反应（PCR）条件需严格控制。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种能定量检测与肝衰竭预后相关的谷胱甘肽S-转移酶M3（GSTM3）基因甲基化程度的检测方法及试剂盒，为肝衰竭的临床诊断和治疗提供科学依据。 

本发明是这样实现的，肝衰竭预后的GSTM3基因甲基化定量检测试剂盒内设有提取外周血基因组DNA的试剂，对基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰的试剂，5×预混PCR反应体系，以及针对目的基因GSTM3启动子的甲基化特异性引物对和Taqman荧光探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和Taqman荧光探针： 

GSTM3-上游引物：5’CGTACGGTTTTGTGGAGTC 3’；

GSTM3-下游引物：5’TCCGAACCTTCGAAAACTAA 3’；

GSTM3-探针: 5’Fam AAACCCACGCGCGAACGCC 3’BHQ1；

ALU-C4-上游引物：5’GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA 3’；

ALU-C4-下游引物：5’ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA 3’；

ALU-C4-探针: 5’Fam CCTACCTTAACCTCCC 3’BHQ1。