[发明专利]用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND) 是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV) 引起的一种烈性病毒性传染病，是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一，也是我国所有鸡病中危害最大的一种，被国际兽医局(OIE) 列为A 类传染病。目前，新城疫在我国全国范围内发病仍然比较普遍，它制约着我国养禽业的发展及禽产品的出口，也对食品安全及人类健康存在潜在的危害。对于该病的控制，在发达国家以捕杀强毒感染群为主，同时结合疫苗接种；而对于广大发展中国家，疫苗接种仍是控制该病的主要手段。随着我国养禽业的迅猛发展，对新城疫的防治越来越重要。因此研制出高效、安全、生产工艺简单、价格低廉、适用的新城疫疫苗有重要意义。

我国目前鸡新城疫活疫苗的生产主要采用传统的鸡胚培养或者转瓶原代细胞培养病毒液制备疫苗。直接采用胚体进行病毒繁殖易受非免疫胚体来源限制，同时采用胚体繁殖病毒，由于培养的病毒悬液中含有大量杂蛋白会给疫苗制备带来安全隐患，另外胚体废弃物处理不当也会存在散毒的危险。转瓶原代细胞培养技术虽然比较成熟，但是制备原代成纤维细胞工序繁琐，并且批次间差异较大，培养的病毒量小毒价低，同时也存在胚体源外源病毒污染的生物安全隐患。

专利公开号为CN102600465A的专利申请，公开了一种鸡新城疫活疫苗的生产方法及其产品，该专利培养新城疫病毒的方法所采用的细胞系包括MDCK细胞系、vero细胞系、marc-145细胞系、ST细胞系、BHK细胞系或MDBK细胞系，而采用鸡胚传代细胞系培养新城疫病毒制备活疫苗的方法并未见报道。上述细胞系针对于禽来说种间差异大，由此制备得来的疫苗对于鸡异源性程度较高，易引起更大的刺激。相对于哺乳动物细胞，鸡胚源传代细胞系更适宜新城疫病毒的增值，制备的疫苗对于鸡更加安全，应激更小。

近年来，生物反应器和微载体技术培养细胞、繁殖病毒在生物制药行业应用广泛。与传统的胚体和转瓶培养工艺相比，悬浮培养技术有着巨大的优势：（1）单位体积内有效工作细胞数量增加；（2）全密闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了污染细胞的机会，而且在减轻劳动强度的同时减少人为操作因素影响；（3）生物反应器容积的扩大，提高了产品的均一性，也提高了产品的产量和质量；（4）生产疫苗所用的成本远低于传统胚体培养工艺与转瓶培养工艺，综合成本大大降低。我国的生物反应器悬浮培养技术起步较晚，但近几年该技术在国内的发展非常快。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法的技术方案，采用该方法制备疫苗生产工艺简单且稳定、易操作，病毒含量高、批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量，生产出的鸡新城疫疫苗安全性好、免疫效力高，对新城疫强毒的攻击具有完全的免疫保护作用。

所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）种细胞的传代与培养：鸡胚传代细胞系DF-1经胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；

2）细胞适应毒种的繁殖：取细胞适应的新城疫病毒毒种，接种于步骤1）中已长成单层的鸡胚传代细胞DF-1中，置37～38℃继续培养，细胞病变率达75%以上时收获病毒悬液；

3）繁殖病毒用细胞的悬浮培养：将步骤1）培养得到的种细胞悬浮液接种至灌注袋中，吸附后在生物反应器中加入细胞生长液进行悬浮培养；

4）病毒的培养与收获：将步骤2）得到的细胞适应的新城疫病毒悬液接种于生物反应器中，换用维持液进行培养，接毒后实时监测糖耗情况，当糖耗接近0时，即开始收获病毒，收获病毒后，反复冻融灌注袋，收获全悬病毒液，经检验合格后置于-20℃保存；

5）鸡新城疫活疫苗制备：将步骤4）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后经配苗、分装和冻干制成鸡新城疫活疫苗；

6）鸡新城疫灭活疫苗制备：将步骤4）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭活检验合格后进行乳化分装制成鸡新城疫灭活疫苗。

所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法，其特征在于所述的步骤3）中生物反应器为激流灌注式生物反应器。