[发明专利]用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法

权利要求书

1.用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）种细胞的传代与培养：鸡胚传代细胞系DF-1经胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；

2）细胞适应毒种的繁殖：取细胞适应的新城疫病毒毒种，接种于步骤1）中已长成单层的鸡胚传代细胞DF-1中，置37～38℃继续培养，细胞病变率达75%以上时收获病毒悬液；

3）繁殖病毒用细胞的悬浮培养：将步骤1）培养得到的种细胞悬浮液接种至灌注袋中，吸附后在生物反应器中加入细胞生长液进行悬浮培养；

4）病毒的培养与收获：将步骤2）得到的细胞适应的新城疫病毒悬液接种于生物反应器中，换用维持液进行培养，接毒后实时监测糖耗情况，当糖耗接近0时，即开始收获病毒，收获病毒后，反复冻融灌注袋，收获全悬病毒液，经检验合格后置于-20℃保存；

5）鸡新城疫活疫苗制备：将步骤4）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后经配苗、分装和冻干制成鸡新城疫活疫苗；

6）鸡新城疫灭活疫苗制备：将步骤4）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭活检验合格后进行乳化分装制成鸡新城疫灭活疫苗。

2.如权利要求1所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法，其特征在于所述的步骤3）中生物反应器为激流灌注式生物反应器。

3.如权利要求1所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法，其特征在于所述的步骤3）中生物反应器的微载体类型为聚酯纤维纸片，使用前用灭菌PBS浸泡过夜。

4.如权利要求1所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法，其特征在于所述的步骤3）中悬浮培养条件为：温度37～38℃，pH7.0～7.6，溶解氧30%～60%，接种量为4～8×10⁹个细胞。

5.如权利要求1所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法，其特征在于所述的步骤3）中悬浮培养时根据细胞糖耗情况随时补糖或者补加细胞生长液，确保残糖不低于1g/L。

6.如权利要求1所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法，其特征在于所述的步骤4）中培养条件为：温度37～38℃，pH7.4～7.6，溶解氧30%～50%。

7.如权利要求1所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法，其特征在于所述的步骤4）中病毒接种量为0.5%。

8.如权利要求1所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法，其特征在于所述的步骤5）中病毒液的病毒含量测定方法为鸡胚半数组织感染量EID₅₀，每0.1ml病毒含量应≥10^8.5EID₅₀。

9.如权利要求1所述的用鸡胚传代细胞系和生物反应器培养新城疫病毒制备疫苗的方法，其特征在于所述的细胞生长液含90%DMEM/F12、8～10%胎牛血清、90～100U/ml抗生素，pH 7.2～7.4，溶解氧为30%～60%，含糖4.0g/L；所述维持液含98%DMEM/F12、2%胎牛血清、90～100U/ml抗生素，其pH 7.2～7.4，溶解氧为30%～50%，含糖4.0g/L。