[发明专利]唾液腺组织特异性的转基因载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种唾液腺组织特异性的高效整合转基因载体及其构建方法，本发明还涉及小鼠腮腺蛋白上游调控区的PCR扩增片段及其克隆方法。

背景技术

传统载体构建主要借助基因工程限制性内切酶、T4连接酶以及PCR技术把目的片段连接到相应的载体骨架上，然后经过酶切鉴定，测序验证，完成载体构建。根据实验需要有时需要连接多个片段，常因限制性酶切位点限制，使实验设计越来越困难，载体片段越来越大而导致T4连接酶效率低下，载体构建难度大。因此，传统载体构建技术在大载体（12Kb以上）载体构建方面很难成功。

腮腺蛋白是腮腺中表达丰度最高的蛋白。腮腺蛋白基因定位在小鼠2号染色体上，在基因组中该基因以单拷贝形式存在，且主要在腮腺特异表达，还有研究显示其在唾液腺的颌下腺和舌下腺也有低表达。研究显示该基因主要是由腮腺蛋白基因的上游调控区（11.5Kb）和下游序列(约2.5～3kb)(即腮腺蛋白启动子PSP)调控的，但其调控基因仅在唾液腺中调控表达，在全身其他组织器官不表达。唾液腺表达外源蛋白的转基因动物原理就是借助腮腺蛋白启动子可以把目的蛋白（酶或者药物）在腮腺、舍下腺以及下颌下腺等唾液腺体经表达后直接分泌到动物唾液中，经口腔进入动物消化道，来发挥其功能。

小鼠腮腺启动子（PSP）载体应用方面最近的报道还是2001年，由加拿大的学者Serguei P.Golovan在制备环境友好动物时应用的，该载体结构比较简单，仅用植酸酶基因代替原来腮腺蛋白基因，没有筛选标记和荧光标记，整合效率也比较低，且整合进基因组多已头尾串联形式，这种整合模式在基因组内，更容易被沉默和丢失，因为没有筛选标记，该载体只适合原核注射或者ICSI（胞浆注射）方法生产转基因动物，动物中经济价值较大是猪，但猪受精卵不透明，看不到原核。且猪早期胚胎收集难度大，技术难题大。其载体结构如图1所示。

2006年由中国农业大学伊海芳构建2个猪腮腺蛋白启动子（PSP）载体，除了载体骨架，这两个载体都采用猪PSP部分上游调控区序列（10kb）连接植酸酶基因，其差异在其后面加尾信号：一个是bGH-pA；另一个是猪腮腺蛋白PSP下游的Poly-PA。这两个载体都带一个药物筛选基因neo。虽然这两个载体可以进行药物筛选，但没有可视标记，对筛选转基因细胞很难确认，仍是传统载体，其整合模式与Serguei P.Golovan构建小鼠腮腺蛋白载体类似。但猪腮腺蛋白启动子由于其研究还不够透彻，目前分析，在其上游10Kb调控区内，调控元件不全，可能在其它区域还存在其它增强子区，导致其下游蛋白酶基因表达量低。2个猪腮腺蛋白启动子（PSP）载体结构如图2所示。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种唾液腺组织特异性的转基因载体及其构建方法。

为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)、分别以质粒pcDNA3.1(+)和pT2AL200R175-CAGGS-EGFP为模板，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物进行第一次PCR扩增，获得带有若干重叠序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5-3μL混合后作为模板进行第二次PCR扩增，纯化得到neo-EGFP融合基因；用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pcDNA3.1(+)和neo-EGFP融合基因，纯化回收酶切产物，连接，构建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP载体；

(2)、以质粒pPB-UbC-EGFP-neo为模板，分别以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、及SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12作为引物，进行PCR扩增得到NotⅠ-5-PB-NotⅠ，XhoⅠ-3-PB-XhoⅠ，分别采用NotⅠ和XhoⅠ酶切后，连接在载体pPSPBGPneo-XynB上，得到载体pPSPBGPneo-PB-XynB；