[发明专利]唾液腺组织特异性的转基因载体及其构建方法

权利要求书

1.一种唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、分别以质粒pcDNA3.1(+)和pT2AL200R175-CAGGS-EGFP为模板，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物进行第一次PCR扩增，获得带有若干重叠序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5-3μL混合后作为模板进行第二次PCR扩增，纯化得到neo-EGFP融合基因；用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pcDNA3.1(+)和neo-EGFP融合基因，纯化回收酶切产物，连接，构建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP载体；

(2)、以质粒pPB-UbC-EGFP-neo为模板，分别以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、及SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12作为引物，进行PCR扩增得到NotⅠ-5-PB-NotⅠ，XhoⅠ-3-PB-XhoⅠ，分别采用NotⅠ和XhoⅠ酶切后，连接在载体pPSPBGPneo-XynB上，得到载体pPSPBGPneo-PB-XynB；

(3)、以步骤(1)得到的pcDNA-neo-T2A-EGFP载体为模板，用长片段PCR体系，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14作为引物进行PCR扩增得到infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段，切胶纯化；用ClaⅠ和BglⅡ双酶切步骤(2)得到的载体pPSPBGPneo-PB-XynB，对目的片段切胶纯化；将infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重组到pPSPBGPNeo-PB-XynB载体的两个loxp位点中间，得到pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB载体；

(4)、以步骤(3)得到的pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB载体为模板，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16作为引物，进行PCR扩增，得到载体中的pPB-lox-neoEGFP-loxp片段，并添加AgeI限制性内切酶位点，纯化，得到新载体骨架；

(5)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4009bp片段，将4009bp片段与新载体骨架pPB-lox-neoEGFP-loxp中的重组序列进行重组，得到中间载体1；

(6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20为引物，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游4706bp片段；将其重组到步骤(5)的中间载体1的StuI位点，即为中间载体2；

(7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段为模板，以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22为引物，利用AgeI位点，扩增得到小鼠腮腺蛋白上游调控区的下游3956bp片段；将其重组到步骤(6)的中间载体2上，得到载体pPB-MusPSP-neo-EGFP，即为唾液腺组织特异性的转基因载体。

2.根据权利要求1所述的唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)-(7)中的小鼠腮腺蛋白基因上游调控区的PCR扩增片段的克隆方法为：以FVB小鼠基因组DNA为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，KOD-FX聚合酶进行第一次PCR扩增；以第一次扩增的产物为模板，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4为引物，进行第二次PCR扩增，即得。

3.根据权利要求2所述的唾液腺组织特异性的转基因载体的构建方法，其特征在于，所述第一次PCR扩增的反应程序为：94℃2min；98℃ 10s，74℃ 13min，5cycles；98℃ 10s，72℃ 13min,5cycles；98℃ 10s，70℃ 13min，5cycles；98℃ 10s,68℃ 13min,30cycles；68℃ 7min；所述第二次PCR扩增的反应程序为：94℃ 2min；98℃ 10s,68℃ 13min,30cycles；68℃ 7min。