[发明专利]一种高品质低分子帕那肝素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说是一种高品质低分子帕那肝素(Parnaparin)的制备方法。

背景技术

肝素是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，在体内和体外都有抗凝血和抗血栓作用。但普通肝素存在生物利用度低、副作用大和半衰期时间短等缺陷，帕那肝素是其换代产品低分子肝素的一种，具有体内半衰期延长、生物利用度高等优点，同时拥有较低的出血危险，是目前主流的抗血栓抗凝血药物。

低分子帕那肝素是经肝素溶解成一定的浓度后，加入一定的氯化钠和乙酸钠，在特定的温度和pH条件下，加入乙酸铜催化剂，通过过氧化氢降解而成。它与肝素产品相比，有着更好的抗血栓活性，更小的出血危险性，以及更低的对血小板的影响。

公开号为CN101942039A的专利文献中公开了“一种帕肝素的生产方法”。该方法通过在精品肝素钠溶液中加入Cu²⁺的催化剂，在特定温度和酸性条件下，采用双氧水降解法获得低分子肝素。在其制备过程中，是以精品肝素钠为原料，难以从原料源头控制最终成品质量；由于在Cu²⁺的存在下，肝素与过氧化物在碱性条件下反应而发生降解。这种降解反应具有较大的随意性，无论是糖醛酸还是葡糖胺之间的糖苷键都可能断裂，从而导致制备出来的低分子肝素样品拥有纯度不够、分子量分布不集中、杂质残留过多等缺点，进而会影响制剂药物的稳定性，在使用过程中容易产生一定风险。而且在降解后对金属Cu²⁺去除过程中，使用的是001x7树脂，会导致产品也被部分吸附，降低了产品的收率。这些都是目前的工艺所不能解决的问题。

发明内容

本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供一种高品质低分子帕那肝素的制备方法。

本发明的技术任务是按以下方式实现的：一种高品质低分子帕那肝素的制备方法，其特征在于：

以粗品肝素钠为原料，粗品肝素钠经木瓜蛋白酶、核糖核酸酶II酶解，氧化脱色、提纯得到精品肝素钠；

精品肝素钠溶解后，在乙酸铜催化剂、过氧化氢作用下进行降解反应；降解反应完成后，以重金属吸附剂或者超滤的方法去除Cu²⁺，并通过膜分离获得具有特定分子量的帕那肝素粗品；

帕那肝素粗品经脱色、醇沉、真空冷冻干燥后得到低分子帕那肝素成品。

上述方法包括以下步骤：

a)酶解：向粗品肝素钠中加入10～12倍量的水溶解，调节料液pH至8.0～8.5，控制料液温度为35℃～40℃，加入适量木瓜蛋白酶及核糖核酸酶II，酶解反应8～10小时，离心去沉淀，上清液过滤，收集滤液；

b)氧化脱色：控制步骤a)中滤液温度为30℃～40℃，调整滤液pH为9～11，加入滤液体积0.3％～0.5％(v/v)的过氧化氢，控温控pH下搅拌反应4-6小时，得纯化液；调节纯化液pH为6～8，加入适量氯化钠，微孔过滤，醇沉，分离得沉淀物；所述氯化钠与纯化液的质量体积比为0.8％～1％(w/v)；

c)超滤除杂：向步骤b)中所获得的沉淀物中加入20～25倍量的纯化水溶解，完全溶解后以截留分子量为3000～10000Da的超滤膜进行5～8小时切向流循环超滤，收集截留液；

d)醇沉除杂：截留液醇沉除杂，所得沉淀物干燥称重；

e)降解：以纯化水溶解步骤d)中所得的沉淀物得到浓度为3％～5％(w/v)的肝素钠溶液，向溶液中加入适量氯化钠和乙酸钠，调节pH至7.5～8.5，再加入适量乙酸铜水溶液及料液体积2.5％～3.5％(v/v)的过氧化氢，在50～55℃下进行降解反应；

所述氯化钠的用量为步骤d)所得沉淀物重量的0.5％～1％(w/w)；

所述乙酸钠的用量为步骤d)所得沉淀物重量的1.5％～2％(w/w)；

所述乙酸铜的用量为步骤d)所得沉淀物重量的2.6％～2.8％(w/w)；

乙酸铜水溶液的浓度为4％(w/v)；

f)去除重金属：利用重金属吸附剂或超滤技术去除料液中的重金属；

g)超滤：去除重金属后调节料液pH至6.8～7.2，用截留分子量为1000Da～3000Da的超滤膜循环超滤控制分子量，直到分子量达到控制标准，收集截留液；截留液醇沉，分离得沉淀物；