[发明专利]通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens 2，3-丁二醇产量

说明书

技术领域

通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens合成2，3-丁二醇产量，属于基因工程技术领域。 

背景技术

随着能源资源的日益短缺和环境问题的日益严重，开发可再生的生物质资源为原料，经过化学、生物及其集成方法生产各种化学品、功能材料和能源物质的生物炼制技术越来越受到国内外的高度重视。2，3-丁二醇是重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、食品、燃料及航空航天等领域。2，3-丁二醇脱氢生成双乙酰，是一种高价值食品风味剂，具有一定的抑菌效果；在脱氢酶的作用下，生成的3-羟基-2-丁酮(乙偶姻)是一种应用广泛的天然食用香料；脱水生成的甲乙酮可作为一种高价值的液体燃料添加剂，亦是重要的低沸点溶剂，应用于涂料、粘结剂、润滑剂、燃料、油墨等行业；脱水生成的1，3-丁二烯可用于合成橡胶、ABS树脂及SBS弹性体等；酯化产品是合成聚酯和聚氨酯的前体。而且2，3-丁二醇是一种极具价值的液体燃料，其燃烧值与甲醇(22.1kJ／g)、乙醇(29.0kJ／g)相当。由于2，3-丁二醇的高辛烷值，它可作为汽油的辛烷值提升剂或航空燃料另外，2，3-丁二醇及其衍生物亦可广泛用于药用载体、增塑剂、柔软剂等的生产。 

近年来用糖质原料发酵生产2，3-丁二醇取得了较好的实验室研究结果，但生物法生产2，3-丁二醇尚未实现工业化。目前报道的2，3-丁二醇生产菌株多为克雷伯氏菌属(Klebsiella)肠杆菌属(Enterobacter)和沙雷氏菌属(Serratia)等，这些菌种具有潜在致病性，不符合符合工业化安全生产的要求。因此，使用安全菌种利用葡萄糖发酵生产2，3-丁二醇具有良好的工业化前景。本发明人在前期研究中筛选得到一株安全菌株Bacillus amyloliquefaciens，该菌具有良好的2，3-丁二醇生产潜力，但是发酵过程中积累较多的副产物如3-羟基-2-丁酮、乳酸和丁二酸等。葡萄糖代谢合成2，3-丁二醇的过程也是一个氧化还原反应，该反应途径中需要辅酶NADH和NAD⁺的参与。葡萄糖首先经过EMP途径生产丙酮酸，此途径中的关键酶3-磷酸甘油醛脱氢酶氧化3-磷酸甘油醛合成磷酸烯醇式丙酮酸，需要氧化型辅酶NAD⁺的参与；随后丙酮酸经过三个关键酶催化合成2，3-丁二醇，而2，3-丁二醇的合成最后一步是乙偶姻还原酶催化还原乙偶姻合成2，3-丁二醇，此反应需要还原型辅酶NADH的参与。3-磷酸甘油醛脱氢酶和乙偶姻还原酶组成一个辅酶循环再生体系。为进一步提高该菌株2，3-丁二醇合成能力，并减少副产物的积累，发明人提出了一种通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens合成2，3-丁二醇能力的方法。 

发明内容

本发明的目的是提供一种通过加强辅酶循环再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens合成2，3-丁二醇能力的方法。 

本发明所使用菌种为Bacillus amyloliquefaciens B10-127(已保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2012年9月14日；保藏编号为： CCTCC NO：M2012349)。本发明首先从解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B10-127中克隆出参与2，3-丁二醇合成途径中辅酶循环再生的关键酶基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)和3-羟基-2-丁酮还原酶(acr)，并将该基因与穿梭表达质粒pMA5-HpaII连接，成功构建了携带基因gapA和acr基因的穿梭表达质粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh，并转入解淀粉芽孢杆菌B10-127中，获得加强gapdh和acr基因表达的解淀粉芽孢杆菌pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh／B.amyloliquefaciens(重新命名为pAG)。并对原始菌及重组菌pAG进行2，3-丁二醇发酵性能检测，说明加强gapdh和acr基因的表达能够提高2，3-丁二醇产量，降低副产物如3-羟基-2-丁酮、乳酸和丁二酸的积累。