[发明专利]通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域，具体涉及通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法。

背景技术

过继性细胞免疫治疗是经体外刺激培养淋巴细胞后回输给肿瘤病人，进行肿瘤治疗的方法。自20世纪80年代，细胞因子IL-2对肿瘤的治疗作用被发现，细胞免疫治疗在临床上的应用迅速扩展，人们先后培养出淋巴因子激活的杀伤性细胞（LAK），肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），细胞因子激活的杀伤性细胞（CIK）。2000年，Yamazaki T等人在柳叶刀杂志（The Lancet）报道了体外扩增活化自体淋巴细胞预防肝癌术后肿瘤复发的随机对照临床实验研究。结果表明这种非特异性免疫治疗极大延长了肝癌患者术后无复发生存时间，而且回输细胞量和杀伤性能与疗效有一定相关性，是一种很有前景的肿瘤治疗方法。

在淋巴细胞体外扩增培养中，不同的扩增步骤、不同的培养基以及是否添加血清对于扩增效果具有不同影响，而是否添加血清对提高淋巴细胞的扩增能力和排除临床使用的潜在安全风险至关重要。

本领域需要一种安全、高效、产品稳定性好、适宜于大规模生产的通过无血清培养来扩增活化淋巴细胞的方法。

发明内容

本发明提供一种通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括：

(a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天；

(b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；

(c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；

(d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；

(e)第四扩增步骤，其中向步骤d)中获得的培养物添加其体积0.5-1.5倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；和

(f)收获步骤(e)中获得的扩增的活化淋巴细胞。

在一些实施方案中，本发明的方法中使用的淋巴细胞活化剂是抗CD3抗体。

在一些实施方案中，本发明的方法中步骤(a)-(e)使用相同的无血清培养基。在一些实施方案中，本发明的方法中使用的无血清培养基含有细胞因子。所述细胞因子可以包括IL-2、IL-7以及INF-γ。本发明的方法使用的培养基中，IL-2的浓度可以是750-1500U/ml，例如1000U/ml；IL-7的浓度可以是1-30U/ml，例如20U/ml；INF-γ的浓度可以是750-1500U/ml，例如1000U/ml。优选地，本发明的方法中使用的无血清培养基是X-VIVO15、TexMACS或IMSF100培养基。更优选地，所使用的无血清培养基为IMSF100培养基。

使用本发明的扩增活化淋巴细胞的方法，所述生物学样品中的淋巴细胞可被扩增100至1000倍。优选地，其中扩增后的细胞主要为CD8+T细胞，例如，所扩增的活化淋巴细胞中，CD8+T细胞可>50%。优选地，所扩增的活化淋巴细胞的活力可保持12小时。

附图说明

图1示出扩增活化淋巴细胞的方法流程图。

图2示出扩增的活化淋巴细胞活力时间变化曲线图。

图3示出五种培养基扩增性能比较和统计学分析。

图4示出不同培养基扩增后的细胞表型百分比和统计学分析。

具体实施方式

本发明提供了一种高效扩增活化淋巴细胞的方法，其使用无血清培养基进行培养，安全、高效、产品稳定性好且适宜于大规模生产。

优化的培养/扩增步骤

本发明提供了一种扩增活化淋巴细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)淋巴细胞活化步骤，其中将含有淋巴细胞的生物学样品与包被于培养容器上的淋巴细胞活化剂相接触并在无血清培养基中培养3-6天；

(b)第一扩增步骤，其中向步骤(a)中获得的培养物加入其体积0.8-1.2倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；

(c)第二扩增步骤，其中向步骤(b)中获得的培养物加入其体积1-1.5倍的无血清培养基，进一步培养1-3天；

(d)第三扩增步骤，其中向步骤c)中获得的培养物添加其体积2-4倍的无血清培养基，进一步培养4-6天；