[发明专利]基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建及应用

权利要求书

1.基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建，其特征在于所述构建包括以下步骤：

（1）Au NPs的制备：将50 mL的质量百分比为0.01%的HAuCl₄溶液加入到100 mL圆底烧瓶中，加热至沸腾后，在机械搅拌下迅速加入1 mL的质量百分浓度为5%的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌并保持沸腾，溶液颜色由黄色变成深酒红色时停止加热，搅拌下自然冷却至室温，即获得平均粒径为13 nm的稳定且单分散的Au NPs，于4 °C保存备用；

（2）Au NPs标记发夹结构DNA的制备：巯基化DNA用100 μL新配制的1 mM二硫苏糖醇溶液活化过柱后，与1 mL步骤（1）制备的Au NPs溶液混合，在摇床上振荡孵育12 h，将产物分散于磷酸盐缓冲溶液中，25 °C放置40 h；在14000 rpm下离心10 min，弃去上清液，离心后的红色油状沉淀用磷酸盐缓冲溶液清洗并离心3次，除去没有与Au NPs反应的DNA；将获得的Au NPs标记的发夹结构DNA重悬于磷酸盐缓冲溶液中，4 °C下保存备用；

（3）SPR适配体传感界面的构建：将金片在体积比7:3的H₂SO₄:H₂O₂混合溶液中浸泡2 min，用二次水冲洗干净，浸入10 mM的巯基己醇溶液中2 h，用二次水冲洗并用氮气吹干后，装入SPR检测池；注入50 μL、1.2 μM的巯基化发夹结构DNA溶液反应2 h，制得预组装了巯基化发夹结构DNA的传感界面。

2.根据权利要求1所述的基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建，其特征在于步骤（2）中，所述的二硫苏糖醇溶液用浓度为170 mM、pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液配制。

3.根据权利要求1所述的基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建，其特征在于步骤（2）中，所述的磷酸盐缓冲溶液浓度为10 mM，pH为7.4，含0.1 M NaCl。

4.根据权利要求1所述的基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建，其特征在于步骤（3）中，所述的巯基己醇溶液用无水乙醇配制。

5.根据权利要求1所述的基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器构建，其特征在于步骤（3）中，所述的巯基化发夹结构DNA溶液用浓度为10 mM、pH为7.4且含0.1 M NaCl的磷酸盐缓冲溶液配制。

6.基于Au NPs和DNA循环双放大技术的适配体传感器的应用，是指它在腺苷检测中的应用：其特征在于，20 μL、1.0 μM的腺苷适配体和相同比例的探针DNA在37 °C孵育2 h，形成适配体/探针DNA双链；加入20 μL不同浓度的腺苷溶液，在37 °C孵育2 h，腺苷与其适配体特异性结合而将探针DNA从适配体/探针DNA双链中释放出来；取25 μL上述溶液加入到25 μL Au NPs标记发夹结构DNA溶液中，将该混合溶液注入到SPR检测池中使其与预组装于传感界面的发夹结构DNA反应1 h；用蠕动泵将反应溶液排出并注入50 μL二次水进行清洗；随着腺苷浓度的增大，捕获到传感界面的Au NPs逐渐增多，SPR响应信号迅速增强，SPR角度变化与腺苷浓度在0.5-50 pM范围内呈良好的线性关系，检测限为0.21 pM，可用于对腺苷的超灵敏和超低浓度检测。