[发明专利]一种座壳孢菌海藻糖酶分离纯化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及海藻糖酶的分离纯化工艺。更具体地，本发明涉及一种座壳孢菌海藻糖酶分离纯化的方法。 

背景技术

海藻糖酶(EC 3.2.1.28)能分解昆虫组织中的海藻糖为葡萄糖用于组织细胞的糖酵解。昆虫组织中的海藻糖分解酶必须得到控制，不像在酵母中，海藻糖分解酶的活性可通过可逆的磷酸化进行调节(崔淑燕，2008)，真菌海藻糖酶能分解昆虫体内的海藻糖，而昆虫体内的海藻糖对昆虫正常生理行为起着至关重要的作用，因此打乱昆虫血液中的海藻糖平衡是发展化学杀虫剂或者从基因水平提高微生物杀虫剂的潜在手段。

座壳孢(Aschersonia)系虫生真菌重要成员之一，是粉虱和介壳虫的主要病原真菌，多发生于拉丁美洲和东南亚,我国南方部分省市柑桔区亦有流行。在该真菌分类、应用和遗传关系等研究的基础上,近年来，人们又开始关注其次生代谢产物的研究。粉虱和介壳虫等生长、发育的各个时期都需要海藻糖，是昆虫体壁的重要的成分之一，通过座壳孢中海藻糖酶降解寄主昆虫体内的海藻糖从而加速寄主死亡。而对座壳孢菌海藻糖酶的研究如海藻糖酶的诱导、纯化、性质以及功能等在国内外并不多见。对海藻糖酶进行分离纯化和其海藻糖酶酶学性质的初步研究，为海藻糖酶基因的克隆表达和揭示虫生真菌致病机理并指导其生产应用奠定基础，可为将来真菌防治害虫的深入研究提供科学依据。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种座壳孢菌海藻糖酶分离纯化的方法，为海藻糖酶基因的克隆表达和揭示虫生真菌致病机理并指导其生产应用奠定基础。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

（1）用优化试验筛选出的培养基培养大子座座壳孢菌菌株，至少每天都测定发酵液浓度，在海藻糖酶活性达最高时取发酵液；

（2）座壳孢菌海藻糖酶，在上述发酵液基础上，由下述纯化方法获得：

（2.1）粗酶液的制备：将发酵液在9500rpm离心10min，上清液用真空抽滤，收集滤液。向滤液中加入固体硫酸铵至饱和度为60%，4℃静置过夜。95000rpm、4℃离心15min收集沉淀，用适量的缓冲液溶解沉淀。95000rpm、4℃离心15min除去不溶物体，上清液装于透析袋经0.02mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.0)透析，再用聚乙二醇PEG20000浓缩，直到透析后的上清液体积不再减少，从而得到粗酶液。

（2.2）DEAE Sepharose fast flow阴离子交换柱层析：用0.02mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.0)充分平衡DEAE Sepharose fast flow阴离子交换柱层析柱，将粗酶液上样，先用0.02mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.0)冲洗层析柱，后换用0-1mol/L NaCl的0.02mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.0)进行连续洗脱。洗脱条件设置为：流速30mL/h；5mL/管，收集具有酶活性部份。

（2.3）Sephadex G-150分子筛层析：用0.02mol/L 磷酸盐缓冲液(pH6.0)充分平衡的Sephadex G-150分子筛层析柱（1.8×100 cm），等上样后，再用相同的缓冲液进行洗脱。洗脱条件设置为：流速15mL/h；5mL/管，收集有酶活性的部份。

（2.4）采用不连续垂直板电泳系统测定海藻糖酶的纯化程度及分子量，分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%，凝胶大小为100 mm×70mm×0.75mm。所用的标准蛋白为：磷酸化酶B97 200；牛血清蛋白66 400；肌动蛋白44 300；碳酸酐酶29 000；大豆蛋白酶抑制剂20 100；乳清蛋白 14 400。电泳后用考马斯亮蓝法显示蛋白条带。

本发明采用的座壳孢菌为大子座座壳孢菌（Jun-Zhi Qiu & Xiong Guan, A new species of Aschersonia (Clavicipitaceae, Hypocreales) from China. MYCOTAXON, 2010, 111: 471-475）。

本工艺特异性高，工艺简单，蛋白质不易失活，纯化效果好，回收率高，成本低，具有很好的推广应用价值。

附图说明

图1海藻糖酶液的DEAE Sepharose fast flow阴离子交换柱层析洗脱图

图2海藻糖酶液的Sephadex G-150分子筛层析洗脱图