[发明专利]一种分离培养家禽内皮祖细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及家禽组织与细胞培养工程领域，特别是一种分离培养家禽内皮祖细胞的方法。

背景技术

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）是一类具有分化为血管内皮细胞的前体细胞，不仅参与胚胎期血管发生，也参与出生后血管新生和血管内皮损伤后的修复过程。当血管内皮受损时，体循环中的EPCs在多种因子的作用下迁移到特定的位点进行分化增生，促进血管修复。EPCs的血管修复作用及定向迁移作用使其在心血管疾病治疗领域及基因靶向治疗领域显示出了广泛的应用前景，是生物医学领域研究的热点之一。

目前，家禽已成为生物医学研究领域的一类重要试验动物，相关研究为医学研究提供了重要的比较医学知识。目前已有从家禽骨髓细胞中分离培养EPCs的报道，但最新的科学研究表明，从骨髓细胞中分离培养的疑似EPCs的细胞并不是真正意义上的EPCs。

对哺乳动物的研究发现，通过培养外周血单个核细胞可获得EPCs。目前常用的方法是：利用淋巴细胞分离液富集外周血单个核细胞，用含有胎牛血清和多种生长因子的EGM-2或EGM-2MV培养基稀释细胞，在37℃、5% CO₂条件下培养，24h后彻底去除未贴壁细胞，继续培养后可获得EPCs。也有研究表明培养非贴壁细胞可获得EPCs。但经我们多次探索后发现，单纯培养贴壁细胞或非贴壁细胞均难以成功获得家禽EPCs，表明分离培养哺乳动物EPCs的方法并不适用于分离培养家禽EPCs。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离培养家禽内皮祖细胞的方法。

一种分离培养家禽内皮祖细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1) 选取20日龄健康肉鸡，翅下静脉采集外周血；

(2) 用L-DMEM培养基按体积比1:1稀释外周血后，再按体积比1:1缓慢滴加到鸡淋巴细胞分离液中，2000 rpm离心15min后弃上清液，收集得到单个核细胞；

(3) 将收集到的单个核细胞用L-DMEM 培养基离心洗涤1-2次，收集细胞，用EGM-2培养基重悬细胞并计数；所述EGM-2培养基含有体积百分比为10%的胎牛血清、100 IU/mL双抗以及血管内皮生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子-1；

(4) 分别将单个核细胞按5×10⁷个/孔、1×10⁷个/孔和1×10⁶个/孔的量种植于用50μg/ml浓度的鼠尾胶原蛋白预先包被过的6孔细胞培养板中，置39℃、5% CO₂培养箱中进行原代培养；每24h半量换液一次；5天后每24 h换液一次，7天后每48h换液一次直到传代。

本发明对家禽内皮祖细胞的分离、培养、纯化等过程，和培养液的成分进行了改进。根据本发明家禽内皮祖细胞的分离培养方法，用贴壁细胞和非贴壁细胞的混合物进行培养，可从家禽外周血中分离培养出大量EPCs。所建立的家禽内皮祖细胞模型可用于家禽血管修复机制、细胞的发育与代谢等相关研究，并为这些研究提供了便利。

附图说明

图1是单个核细胞初始接种量对分离培养EPCs的影响示意图。其中，A．5×10⁷个/孔（200×）； B．1×10⁷个/孔（100×）； C．1×10⁶个/孔（200×）。

图2是EPCs细胞形态学观察图。其中A．3d后细胞大部分贴壁并开始出现梭形细胞（100×）； B．细胞呈克隆性生长（100×）； C．7 d后出现大量梭状细胞（100×）； D．10 d后细胞呈现典型铺路石样外观（100×）。

图3是EPCs细胞双荧光染色结果图。A.阴性对照； B. Dil-ac-LDL阳性细胞；C. FITC-UEA-I 阳性细胞； D. Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性细胞（B和C叠加）。

图4是EPCs表面标志物检测结果图。A: CD31、CD133和VEGFR-2 mRNA的表达； B: CD34 mRNA的表达。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

1材料与方法

1.1实验动物

20日龄健康AA肉鸡。

细胞培养板的处理