[发明专利]一种快速检测番木瓜环斑病毒胶体金免疫试纸条

说明书

技术领域

本发明属于植物病害病原诊断技术领域，涉及一种植物病毒的快速诊断方法，特别是涉及一种检测番木瓜环斑病毒免疫胶体金试纸条的制备与应用。 

背景技术

番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）是马铃薯Y病毒属的重要成员，是引起番木瓜病毒病的重要病毒之一。20世纪40年代美国首次报道了此病毒。我国于20世纪50年代初引进了番木瓜进行种植生产，1959年便在番木瓜上发现了该病毒，1962年后PRSV在我国广泛流行。番木瓜植株一旦受到PRSV的侵染，死亡率可高达90%，使番木瓜生产受到毁灭性的打击。2000年海南省种植的上千亩番木瓜因PRSV的侵染而几乎绝收。由于PRSV的严重为害，我国多个地区番木瓜生产被迫采取春植秋砍的种植方式，即春天的时候将番木瓜幼苗种下，而在秋天的时候将树砍掉，使多年生的番木瓜人为变成一年生的植物种植，不但给生产上带来了很大的麻烦，同时也造成了严重的经济损失。田间的早期诊断是植物病毒病有效防控的关键环节。目前，用于番木瓜环斑病毒病病原诊断的方法主要有传统生物学方法、酶联免疫吸附测定法（ELISA）和分子生物学方法。传统生物学方法鉴定病毒虽然操作简单，无需特殊仪器设备，但存在以下不足之处：（1）需要采用一系列的鉴别寄主进行鉴定，且非专业人员常面临着对出现的症状难以准确判断的问题。（2）在实际鉴定中，往往多种病毒复合侵染寄主，使症状产生极大的变化，不易判断；（3）鉴定速度慢，周期长。接种后鉴别寄主产生症状所需的时间一般在3天以上，有的甚至长达20天以上；（4）鉴定结果易受季节和周边环境的影响，且需要一个相对独立的空间，避免病毒的交叉传染；（5）有些病毒尚无合适的鉴别寄主，无法采用传统生物学方法进行鉴定。酶联免疫吸附测定法和分子生物学方法检测病毒虽具有检测特异性强、灵敏度高、检测时间较传统生物学方法短的优点，但至少也存在以下不足：（1）这两种方法都需要特殊的仪器设备，且操作人员一般要经过专门的培训，使得这两种检测病毒的方法只能在实验室内完成，不利于在基层单位进行推广和使用；（2）与传统生物学方法相比，检测时间虽有很大的缩短，但所需时间至少也要数小时，仍不适用于田间现场的快速检测；（3）检测所需的成本较高，特别是分子生物学检测方法，需要使用昂贵的试剂。胶体金免疫试纸条是采用胶体金标记技术研制而成的，胶体金是氯金酸（HAuCl₄） 的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。胶体金标记技术就是通过调节还原剂的加入量，制备出不同大小和颜色的胶体金颗粒，这些胶体金颗粒对蛋白有很强的吸附性，能够与免疫球蛋白非共价键结合形成肉眼可以看到红或粉红的颜色。胶体金免疫试纸条检测法的优点在于无需借助实验室设备和专业技术人员，只需要取少量的植物汁液滴在试纸条上的样品垫上，便可在十几分钟甚至几分钟内得到检测结果，具有安全简便、无放射性污染、灵敏度高、结果准确、成本低等特点，适合对植物病毒的现场检测。 

发明内容

本发明旨在提供一种快速检测番木瓜环斑病毒的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，解决目前田间现场快速检测番木瓜环斑病毒尚缺少有效手段问题。本发明制备的试纸条具有操作简单、检测快速、结果准确可靠、成本低廉、无需借助特殊的仪器设备，适用于田间现场检测等特点，可用于田间病株的早期诊断，为番木瓜环斑病毒病的防治提供有效的预警，提高番木瓜环斑病毒病的防治效率，减少由其造成的经济损失。

       一种检测番木瓜环斑病毒免疫胶体金试纸条，其特征在于制备方法包括下述步骤：

1)        PRSV的提纯：将PRSV-Vb株系摩擦接种于系统感染寄主西葫芦上，以出现典型症状的西葫芦叶片为提纯PRSV的材料进行提纯，得提纯的番木瓜环斑病毒；

2)        多克隆抗体的制备：以步骤1）提纯的PRSV为抗原，弗氏佐剂为乳化剂，按常规方法免疫新西兰大白兔，制备抗PRSV的多克隆抗体；

3)        多克隆抗体纯化：对步骤2)所制备的抗PRSV多克隆抗体进行纯化；

4)        胶体金溶液的制备：按100 mL 0.01% w/v的四氯金酸溶液用1.5 mL–3 mL的1% w/v柠檬酸钠溶液还原的比例制备胶体金溶液，溶液搅拌煮沸15 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液于4℃条件下保存；