[发明专利]G6PDH基因片段作为柑橘大实蝇胁迫条件下稳定表达的内参基因的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及G6PDH基因片段作为柑橘大实蝇胁迫条件下稳定表达的内参基因的应用。

背景技术

昆虫是变温动物，对温度非常敏感。在不利的高低温胁迫条件下，昆虫往往会优先采用提高自身生理适应能力作为首选生存策略。因此，研究昆虫对高低温的适应机制能从更深层次理解胁迫环境下物种所采取的生存选择对策。生物体感知外界的温度刺激，将信号传入体内，并在体内呈现一系列的基因应激表达以应对外界的胁迫。为了更好的理解基因水平上昆虫适应高低温的机理，研究应激基因在逆境下的表达调控具有重要作用。无论是通过实时荧光定量PCR、RNA印迹和基因芯片等对基因进行表达定量，还是通过蛋白质印迹等对蛋白质进行表达定量，都需要应用内参基因对目标基因表达量进行校正，以期获得真实可靠的结果。看家基因众多，理想的看家基因应在各种实验条件下、各种类型的组织或细胞中均恒定表达。然而，盲目地使用一种看家基因作为内参，有可能得出错误甚至相反的结论。因此在选择使用一个内参基因时，应首先验证其在特定的实验条件下是否能够持续稳定的表达。

柑橘大实蝇(Bactrocera(Tetrad1acus)minax)属昆虫纲，双翅目，实蝇科，离腹寡毛实蝇属，俗称柑蛆，是危害柑橘类果树的重要害虫、国际植物检疫有害生物。在我国主要分布于四川、重庆、湖北、贵州、云南、陕西、广西、广东、湖南等省、自治区、直辖市。柑橘大实蝇属于全变态类昆虫，其完成一个生命周期需要经过卵、幼虫、蛹及成虫四种虫态。柑橘大实蝇一年只发生1代，成虫活动期可从6月上旬持续至9月底，幼虫活动期从7月中下旬至11月下旬。此外，诸多报道表明，辐照不育是防控柑橘大实蝇的一种有效方法。本发明选取的G6PDH(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)内参基因，通过半定量RT-PCR技术检测表明成虫在35℃高温和辐照条件下，以及幼虫在4℃低温胁迫下均能稳定表达，为研究柑橘大实蝇功能及在不同胁迫条件下表达奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供G6PDH基因片段作为柑橘大实蝇不同胁迫条件下的内参基因的应用，其中，所述G6PDH基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：CGAGCAGGCCATGTATGAGGAGTTCTGGCACAGTCACACCTATGCTGCAGGCAGCTATAATCAGCGCAGCGATTTCGTTGCCTTGAAGGAACAATTGGAGCGTCTGGAGTGCCGTTGCAGCTGCAATCGCATATTTTACTTGGCTTTGCCGC。

根据本发明的具体实施方式，在检测上述G6PDH基因片段是否作为内参基因在不同胁迫条件下稳定表达时，使用：

BM-G6PDH-F1：5′-CGAGCAGGCCATGTATGA-3′；和

BM-G6PDH-R1：5′-GCGGCAAAGCCAAGTAAA-3′。

根据本发明的具体实施方式，柑橘大实蝇G6PDH基因152bp核苷酸片段的克隆方法，包括以下步骤：

(1)从柑橘大实蝇中提取总RNA，然后反转录合成cDNA：

(2)设计引物：

(3)以cDNA为模板，利用(2)所设引物，PCR扩增柑橘大实蝇G6PDH内参基因的核苷酸序列片段；

(4)纯化步骤(3)所得PCR产物，琼脂凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pEASY-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞Transl-T，37℃平板培养过夜，蓝白斑筛选含G6PDH片段的阳性克隆子；

(5)将(4)所获得的阳性克隆子进行序列测序，测序所得的序列在NCBI上BLAST分析比较，进而确定所得的核苷酸序列为柑橘大实蝇的G6PDH片段序列。

本发明所获得的柑橘大实蝇BM-G6PDH的152bp的核苷酸序列可作为今后研究柑橘大实蝇的功能基因及在不同胁迫条件基因表达的内参基因。

附图说明

图1BM-G6PDH内参基因在柑橘大实蝇不同胁迫条件下的表达状况：A-表示35℃胁迫1h，3h，5h及辐照90Gy后的表达状况；B-表示4℃胁迫12h，36h，48h及60h后的表达状况；

图2BM-G6PDH内参基因在柑橘大实蝇不同胁迫条件下的相对表达量：A-表示35℃胁迫1h，3h，5h及辐照90Gy后的相对表达量；B-表示4℃胁迫12h，36h，48h及60h后的相对表达量。

具体实施方式

实施例1：柑橘大实蝇内参基因BM-G6PDH在不同胁迫条件下的表达分析