[发明专利]一株厌氧利用合成培养基高产丁二酸大肠杆菌的筛选及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株通过常温低压等离子诱变选育得到的在纯厌氧条件下可利用合成培养基消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液生长产丁二酸的大肠杆菌，以及其在发酵工业中的应用，属于工业微生物育种及其发酵技术领域。

背景技术

丁二酸又称琥珀酸，是三羧酸循环的中间产物，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。其作为优秀的C₄平台化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS）类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制品之一。

丁二酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间产物，可经由多种细菌的代谢途径获得。微生物发酵法生产丁二酸因其具有利用可再生资源，固定温室气体CO₂等优点而越来越引起人们的关注。而大肠杆菌由于具有培养条件简单，代谢网络较明确，易改造，易操作等特点，近年来成为生物法合成丁二酸的研究热点。目前,丁二酸工业发酵菌株的研究主要集中在产丁二酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)，产丁二酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，和大肠杆菌(Escherichia coli)等。其中Escherichia coli由于遗传背景清楚，基因操作简单，生长速度快，易调控以及所用培养基较为廉价，近年来成为生物法制备丁二酸的研究热点。

大肠杆菌在氧气缺乏的情况下，丁二酸主要的产生途径为葡萄糖经过糖酵解途经生成磷酸烯醇式丙酮酸，并进而代谢合成草酰乙酸、苹果酸、富马酸，最终以丁二酸的形式积累。G.N.Vemuri等人报道利用大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的方法，原理是有氧阶段是菌体得到快速积累，然后转为厌氧使菌体产生大量的丁二酸。然而两阶段发酵过程中，需要消耗大量的营养成分用于菌体的生长，导致丁二酸总得率下降，同时由于菌体有氧生长对溶氧要求较高，搅拌及冷却等所需要较高的能耗及成本投入，因此，一步厌氧发酵产丁二酸受到越来越多的关注。然而在纯厌氧条件下，大肠杆菌生产丁二酸需要酵母粉、蛋白胨等复合氮源作为培养基成分，与无机氮源(NH₄)₂HPO₄组成的合成培养基等相比，价格过于昂贵，为此，需要通过对生产菌株进行进一步的筛选，获得能够利用合成培养基生长合成丁二酸的生产菌株。

本申请人的在先专利中国专利申请菌株BA204（公开号CN102399738A，保藏编号CCTCCNO：M2011207），该菌株能够在厌氧条件下利用复合培养基消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液合成丁二酸，但在合成培养基中只能积累少量丁二酸，因此，本发明在该申请的基础上，通过菌株改良，使BA204可以在纯厌氧条件下利用廉价合成培养基消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液合成丁二酸，在今后的丁二酸生产工业中具有长远意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于培育一株能够在纯厌氧条件下利用廉价合成培养基消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液合成丁二酸的大肠杆菌，同时提供该大肠杆菌的筛选方法。

本发明要解决的技术问题之二在于提供所述大肠杆菌菌株的在发酵生产丁二酸中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一、本发明培育了一株能够在纯厌氧条件下利用廉价合成培养基消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液合成丁二酸的大肠杆菌，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA308，其保藏号登记号为：CCTCCNO：M2013159。

二、本发明所述的在纯厌氧条件下利用廉价合成培养基消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液合成丁二酸的大肠杆菌Escherichia coliBA308的筛选方法。

本发明所采用的筛选方法是将大肠杆菌的出发菌株经等离子体诱变后，筛选得到在厌氧条件下能够利用合成培养基，消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液生长的菌株，再经厌氧摇瓶发酵筛选获得可以高产丁二酸的目标菌株。

其中，所述的大肠杆菌出发菌为BA204，其保藏编号CCTCCNO：M2011207。

具体的筛选菌体步骤如下：