[发明专利]一株大熊猫链球菌SDX-1株及其PCR非诊断性检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株大熊猫链球菌(Streptococcus ailuropoda sp.novel)SDX-1株及其PCR非诊断性检测方法。

背景技术

链球菌属隶属链球菌科。链球菌属细菌为兼性厌氧、触酶阴性、不形成芽孢、不运动的革兰氏阳性球菌。细胞呈球形或卵圆形，直径0.5～2.0μm。在液体培养基中以成对或链状出现。生长营养要求高，有时需要CO₂。DNA的G+C mol含量为36～46％。寄生于脊椎动物，主要栖息口腔和上呼吸道；有的重对人和动物致病。

近年来，由于分子生物学技术的发展，DNA-DNA杂交、DNAG+C mol含量测定、16S rRNA序列分析等在细菌分类中广泛应用。1986年Bergey’s Manual将原链球菌属分为了链球菌属、肠球菌属和乳链球菌属3个属。1933年Lancefield建立的血清学方法仍是现在链球菌鉴定的重要手段。根据溶血性不同将其分为α溶血性链球菌、β溶血性链球菌和不溶血性链球菌等几个大群。目前为止链球菌属至少由60多个菌种和亚种组成。

链球菌在自然界中分布广泛，水、尘埃、动物体表、消化道、呼吸道等都有存在，有些为非致病菌，有些能导致动物的各种化脓性疾病、肺炎、乳腺炎和败血症等近年来陆续有链球菌感染大熊猫的报道。张志和等曾报道了β链球菌感染大熊猫的病例。王旭等从大熊猫化脓脚掌感染部位浓汁中分离了停乳链球菌。除此外还从其他大熊猫的鼻腔、咽喉、粪便分别分离到非解乳链球菌、猪链球菌和多动物链球菌，从患牙周炎大熊猫口腔中也分离到停乳链球菌。

链球菌感染初期，机体临床症状不明显，不易被发现。当临床症状明显时，已对机体造成严重危害。链球菌传统的检测方法是分离培养后结合形态学特征、生理生化特征等进行鉴定，不仅费时费力，而且敏感性不高。贾玉萍等建立巢氏PCR方法检测无乳链球菌16S rRNA，可简便、快速检测到奶样中的无乳链球菌，马保臣等跟军16S rRNA与23S rRNA之间序列和18S rRNA序列建立多重PCR方法检测奶牛金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌。因此建立简便、快速方法来检测致病性链球菌对于链球菌病诊断、预防和监测具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一株大熊猫链球菌SDX-1株及其PCR非诊断性检测方法

本发明的技术方案如下：

大熊猫链球菌SDX-1株(Streptococcus ailuropoda sp.novel，SDX-1 strain)，于2012年6月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M2012249。

本发明建立的快速检测大熊猫链球菌的PCR方法具有较强的特异性和敏感性。

附图说明

图1为SDX-1株与16SrDNA序列同源性高的链球菌进化发育树；

图2为SDX-1株16-23SrRNA序列PCR扩增结果，M：DNA Marker D2000，1：PCR产物；

图3为特异性试验结果，M：DNA Marker D2000；1：大熊猫链球菌SDX-1；2：化脓性链球菌JCM5764；3：S.ictaluri ATCC BAA1300；4：停乳链球菌；5：非解乳链球菌；6：多动物链球菌；

图4为敏感性试验结果，M：DNA Marker D2000；1：5.28ng×10；2：5.28ng；3：5.28ng×10^-1；4：5.28ng×10^-2；5：5.28ng×10^-3；6：5.28ng×10^-4；7：5.28ng×10^-5；7：5.28ng×10^-6；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1：大熊猫链球菌SDX-1的分离培养

1)将从患子宫内膜炎大熊猫无菌采取的子宫内分泌物分别接种于TSA培养基和含10％血清的TSA固体培养基上，37℃培养24h，观察生长情况。

2)观察TSA固体培养基上细菌生长情况，其在不加血清的TSA培养基上细菌生长贫瘠，在加血清的TSA培养基上的优势菌落为乳白色不透明小菌落。挑取其中单个优势菌落接种于加血清的TSA培养上置于恒温培养箱中，37℃，培养24h，进行纯化。