[发明专利]一种用于眼表修复的生物膜及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域，具体涉及一种用于眼表修复的生物膜及其制备方法。

背景技术

羊膜，从细胞滋养层衍化而来，是胚胎双层膜的内层，由上皮细胞层，基底膜和无血管基质组成，羊膜中包含多种胶原蛋白以及层粘连蛋白、纤连蛋白、糖胺聚糖、透明质酸等。正是这些活性物质的存在，可以促进上皮细胞的黏附移行，诱导上皮分化，防止上皮凋亡，使得羊膜充当一种“可移植的基底膜”来促进上皮化。此外，羊膜基质中还包含有很多生长因子，比如神经生长因子（NGF），肝细胞生长因子（HGF），角质细胞生长因子（KGF），转化生长因子-α（TGF-α），转化生长因子-β1(TGF-β1），表皮生长因子(EGF），碱性成纤维细胞生长因子(bFGF）（Koizumi, N.J, et al, Growth factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane. Curr Eye Res, 2000. 20(3): p. 173-7），抑制血管生成、抗炎的蛋白(Hao, Y. et, al, Identification of antiangiogenic and antiinflammatory proteins in human amniotic membrane. Cornea, 2000. 19(3): p. 348-52)以及一些天然蛋白酶抑制因子(BK, N, et al, Analysis of human amniotic membrane components as proteinase inhibitors for development of therapeutic agent of recalcitrant keratitis. Trophoblast Res, 1999(13): p. 459-466.)，它们能够促进眼表上皮化、减轻炎性反应、抑制纤维组织增生和新生血管形成。因此，近年来羊膜在眼表重建中的应用备受瞩目。

由于新鲜羊膜和冷藏羊膜能够最大程度地保留各种天然胶原及活性因子成分，因此临床使用效果较好。但因这类羊膜未经病毒灭活处理，无法确保其无菌状态，存在病毒传播隐患。近年来国内外也有一些羊膜产品，都是经过冻干、脱细胞处理或常温风干处理；虽然，经过冻干的羊膜可以达到理想含水率（一般1～10%），但在冻结、冻融、干燥和储存过程中, 存在多种诱导蛋白质变性因素（如冷冻保护剂及冻干保护剂的选择，冷冻速率的选择等），使冻干过程不易控制、耗时长、成本高，容易造成蛋白质变性、羊膜变脆，导致羊膜在手术中容易撕裂，需要反复更换，延长手术时间；而常温风干、晾干的方法使水分挥发过程较长，且干燥脱水的效果不理想(一般含水率>13%)，；另外，羊膜经脱细胞处理后损失大量天然胶原，尤其是活性因子成分，影响了临床使用效果。

美国专利US006152142A和US006326019B1公开的羊膜产品是剖腹产胎盘经清洗干净后钝性分离去除绒毛膜，上皮向上平铺在硝酸纤维滤纸上，之后按1：1保存于DMEM：甘油中，于-80℃冰箱中冻存，所制备的羊膜未经脱细胞、干燥和灭菌处理，因此最大程度地保留了羊膜成分与结构的完整性；但存在的问题有：① 保存成本太高，且不方便运输；② 在保存时经过了低温冷冻，使用时又需室温解冻，这两个过程都会造成羊膜胶原蛋白结构的破坏，变得易碎；③ 制备中采用硝酸纤维素滤纸为衬底，在使用中需要将羊膜撕下来，使得本来就易碎的羊膜更容易发生撕裂或卷曲，给临床操作带来诸多不便；④ 对羊膜未进行病毒灭活处理，具有病毒传播隐患。

中国专利CN03150838.3和中国专利CN200480023933.7及中国专利申请200410075361.9公开了一种可常温保存的生物羊膜的制备方法，是将胎盘的绒毛膜钝性分离，清洗后铺在硝酸纤维素滤纸上，经冷冻干燥后包装，钴60辐照灭菌。所制备的羊膜，与上述美国专利类似，经过了低温冷冻，同样在一定程度上对羊膜造成了破坏，使其变脆，在临床使用中容易撕裂；其也采用硝酸纤维素滤纸作为衬底，使用时羊膜不易取下，且容易发生卷曲，给手术带来不必要的麻烦，耗费手术时间，耽误病情。

中国专利申请201010113960.0公开了一种在低温下（-20～4℃）使用基质胶对羊膜基质进行重建及修复，采用有色染料染色，铺膜、干燥后用钴60消毒，从而较好地保存了羊膜上皮及基底，但在低于零度条件下进行羊膜基质重建，仍会造成羊膜变脆；铺膜后将羊膜从衬底上撕下会造成撕裂或卷曲，并难以辨识羊膜的上皮面和基底面，给临床操作带来麻烦。