[发明专利]基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于基因工程中单核苷酸多态性和单碱基突变的检测领域，特别涉及一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及其试剂盒。

背景技术

单核苷酸多态性（SNPs）是指在基因组水平上，特定核苷酸位置上存在两种或两种以上不同的碱基，其中任何一种等位基因在群体中的频率不小于1%。随着人类基因组测序工作完成，SNPs筛选及检测已经成为研究者们广泛关注的焦点。目前用于SNPs检测的方法大多以PCR技术为基础，与荧光、质谱法、基因芯片或直接测序等方法结合，并已进入SNPs检测的高通量时代。但这些方法大多操作复杂、价格昂贵、检测时间长，因此并不适合于大规模使用。本发明利用PCR&AS-PCR核酸扩增技术和DNA溶解曲线技术发明的一种操作简单、价格低廉的检测技术。因此，可广泛地应用于与单核苷酸多态性检测相关的领域。

以下是现有的几种SNP检测技术，如1、限制性酶切片断长度多态（RFLP）：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNPs位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据琼脂糖凝胶电泳的结果就可以判断是否有SNPs位点以及出现的碱基替换的类型。2、寡核苷酸连接分析（Oligos Ligation Assay,OLA）：OLA技术是通过设计两种能与靶序列DNA精确并列杂交的寡核苷酸来完成的。寡核苷酸杂交后，DNA连接酶可使其正常配对的相邻碱基以共价连接。连接产物可以通过凝胶电泳或固相印迹杂交的方法进行检测，根据这些检测结果就可以进行SNPs的分型。3、基因芯片（Gene chip）：基因芯片，又称为DNA微探针阵列（Micro-array）。虽然仅用一张芯片，就可以通过芯片上密集排列的已知序列的探针，与若干靶序列进行互补匹配杂交，从而达到同时检测多个基因的多态性的目的。4、实时荧光定量PCR（Real-time Quantitive PCR）：根据荧光共振（Fluorescence resonance）的原理，利用荧光检测装置检测供试者-接受者（donor-acceptor）之间的荧光变化，从而进行SNPs的分型。5．DNA测序法：DNA Sanger测序能够准确、直接反应序列的差异，但是从操作周期来看，该方法从样品的处理到给出报告至少需要3-4天，而且价格也比较昂贵。6、荧光偏振检测技术（Fluorescence polarization）：对目的基因进行PCR扩增，然后用特异探针与扩增产物中待测核苷酸的下游序列杂交，使探针的3’可在聚合酶的作用下，依据其互补链上的待测碱基连接上一个标有特定荧光素的ddNTP，然后检测该3’端带有荧光素的探针，根据检测到的荧光素种类和偏振光强度判定待测点是何种碱基。7、杂交双探针荧光PCR技术：杂交双探针荧光PCR技术除常规的一对引物外，还在PCR反应体系中另加有两个能与PCR产物杂交的横跨突变位点的荧光标记探针。通过熔解曲线(melting curve)的分析而对DNA变性过程的监控实现点突变的检测。

随着人基因组测序的完成，各种SNPs数据库不断的建成，SNPs的功能研究逐步转为科学家们研究的重点。同时，越来越多的研究证明很多遗传病都与基因组上存在单碱基突变相关。因此针对不同特定DNA区域上的不同的SNPs类型在特定群体的序列验证和频率分析以及基因片段上的突变位点与特定生理或病理状态关系正成为研究的热点。但目前市场上，针对多个基因片段中的多个基因位点上的单碱基点突变的检测方法大多需要专门的分析仪器，不仅价格昂贵，而且操作复杂，所以在应用上受到了一定的限制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及其试剂盒，从对样本核酸的提取到给出检测结果，只需要2～3小时，同时还具有结果判读简单，检测通量大，检测成本低的优点。因此可在一般的分子实验室和医院检验科完成相应的检测；在临床检验进行使用，可大大增加临床诊断的准确性，缩短患者就医的时间，也可医疗保健系统成本降低。

本发明的一种基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法，包括：

（1）在同一PCR扩增体系中，设计一对扩增引物A，通过PCR对包含SNPs和单碱基突变的位点目标靶模板进行扩增；通过位点特异性引物B，针对SNPs基因型和单碱基突变的类型进行位点特异性区分的AS-PCR扩增；

（2）通过对溶液中能与DNA双链结合的荧光染料监测和产物溶解曲线分析程序，检测步骤（1）扩增产物中单核苷酸多态性的基因型。