[发明专利]一种组织样品高分辨率断层光学显微成像装置

说明书

技术领域

本发明为一种基于机械切削实现组织样品断层显微成像的装置。

背景技术

对组织样品进行高分辨率断层光学显微成像，再进行三维重建，可以获得亚细胞结构的三维空间分布，对于神经组织，则可以实现特定神经元树突和轴突的三维空间分布的追踪，从而了解神经元之间的相互连接关系。

为了实现组织样品的断层光学显微成像，可以采用光学层析成像技术：共聚焦成像技术，通过使用共焦小孔阻挡聚焦面以外的信号，实现层析；双光子显微成像技术，利用非线性效应，有效的光学信号只来源于焦点位置，实现层析；另外，也有近年来受到较多关注的光片照明层析技术，将激发光整形为微米厚度的薄层光片，照明样品中垂直于探测光轴的一个面，实现层析。这些光学层析成像方法，首先于组织样品对光的散射和吸收，所能达到的成像深度限制在1mm以内，如果需要对更大的组织样品进行成像，则需要结合组织样品的光透明处理以及机械切片过程。

机械切片结合光学显微成像方法理论上不会受制于组织样品的尺寸和光学特性。结合机械切片与光学显微成像有多种方式。最为传统和直接的方式是先对组织样品进行切片，再将切片转移到载玻片上进行光学成像。切片和切片的制备过程费时，并且因为很难保证不同切片固定和成像位置的一致性，需要对不同切片的图像进行空间位置的配准才能进行后续的三维图像重建。另一种方式是对组织样品的表面进行显微光学成像或者对组织样品的浅表的几百微米厚度进行光学成像，再去除（机械切削或激光消融）组织样品浅表已成像的部分。因为来自表面以下组织样品信号的干扰，需要借助光学层析成像技术。第三种方式是对组织样品进行塑性包埋，进行微米厚度的薄切片，同时在切片过程的同时，对切下并贴覆在切削刀具背面的组织样品切削条进行同步的成像。这种方式切下的组织样品薄切片与剩余的组织样品在空间上有一定的分离（取决于刀具的厚度），但因为对塑性包埋的组织样品进行薄切片一般使用透明的金刚石刀，使得金刚石刀下方剩余的样品仍会透过金刚石刀而对光学成像结果造成影响，在图像中叠加上干扰背景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提出一种通过机械切削方式和显微光学成像实现组织样品断层成像装置。

为解决上述技术问题，本发明首先提出了一种组织样品高分辨率断层显微成像装置，包括组织样品切片模块和光学显微成像系统；所述组织样品切片模块包括三维电控移动平台，样品槽和切削刀具，所述样品槽安装在所述三维电控移动平台上，包埋的组织样品固定于所述样品槽中，所述切削刀具固定安装在所述样品槽上方，所述切削刀具的切削面与所述组织样品上表面成钝角相交，所述光学显微成像系统与所述切削刀具相对位置固定，且聚焦于所述切削刀具头；所述切削刀具进行不透明处理。

优选的，所述切削刀具的不透明处理包括，采用在激发或照明光波长范围内不透明的材质制作刀具，或者，对刀具表面进行硬质光学镀膜处理，通过镀膜实现激发或照明光波长范围内的低透过率或高反射率。

所述刀具可以是可见光波段透明的硬质刀具，但对其进行光学镀膜处理，使其在照明或激发光波段呈现低透过率。为了得到微米厚度的薄组织切片，使用硬质刀具，如金刚石刀具。由于金刚石的透明特性，可以在刀具表面镀反射膜，使金刚石刀在成像系统所使用的照明光或激发光波长范围内呈现很低的透过率，从而阻挡切削过程中，对刀具下方组织样品的照明或激发，从而抑制下方组织样品对刀面上方组织切片的干扰。所述刀具也可使用其他非透明材质的刀具，从而无需镀膜处理。

所述显微光学成像模块包括显微物镜和成像部分。显微物镜与刀具的相对位置固定，通过调节显微物镜使其光轴垂直于刀具表面，且焦点处于刀具表面。可以对切削过程中刀具表面的组织样品进行清晰成像。采用落射照明方式，显微物镜同时起到聚焦照明光或激发光于刀具表面组织切片，以及收集组织切片信号光的作用。

优选的，所述光学显微成像系统采用扫描成像方式，扫描成像方式通过物镜将照明光或激发光聚焦于刀具表面的组织切片，结合光束扫描器件和光探测器实现组织切片的扫描成像。以电控三维移动平台的位置反馈信号为同步信号，同步扫描成像与切片过程，从而保证各断层图像相对位置的一致性。

所述显微光学成像还可以采用的成像方式可以使用宽场照明结合阵列探测器进行成像。因为不透明刀具的使用，可以直接对样品进行宽场照明（面照明或更为集中的线照明），同时使用阵列探测器实现显微图像的捕捉。因为切片过程中待成像的切片处于运动状态，需要通过电控三维移动平台的位置反馈信号逐行触发阵列探测器的曝光和读出。

本发明的组织样品高分辨率断层显微成像装置的成像方法，包括以下步骤：