[发明专利]花生耐渍涝的非共生血红蛋白基因AhGLB及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种花生耐涝基因AhGLB，本发明还涉及所述花生耐涝基因的用途以及不同基因型花生受到不同胁迫处理时该基因的特异表达情况，揭示该基因的功能。

背景技术

花生是我国主要的油料作物和经济作物，是我国最具竞争力的出口创汇农产品。水分是影响植物的生长、发育、代谢和生态地理分布的重要的生态因子之一。由水分造成的胁迫一般分为两种，干旱胁迫和渍涝缺氧胁迫，两者对植物生理生态造成的危害非常大。其中湿涝对世界花生产量影响颇深，在亚洲(尤其是东南亚)、南美洲花生产区湿涝与干旱往往交替发生，雨季明显，是世界花生湿涝危害的重灾区。由于国内外对花生的研究普遍注重于抗旱一方面，对花生渍涝危害的认识不够充分，花生渍涝研究无体系、不深入，整体上仍处于初始阶段，而我国花生产区常分布于湿润、半湿润气候区，旱涝往往交替发生，特别是南方产区涝害尤其明显，其中长江中下游地区的春涝、春夏连涝；华南产区的夏秋涝；以及平原花生区和华南稻田花生区渍涝等，都是涝害十分严重的受灾区，据预测，随着全球气候变暖，我国南方花生的湿涝问题将更加突出，在花生的生长发育过程中，渍涝缺氧胁迫的影响不容忽视，它将影响花生对氧分和营养的吸收，同时也会改变花生的农艺性状等。我国作为当今世界花生生产、外贸第一大国，同时作为渍涝严重受害国之一，对花生涝害防治研究亟待加强，但是，迄今为止除了对涝害或土壤过湿对花生产量的影响和化学调控研究以外，很少涉及内部机理的深入研究，因此花生湿涝机理研究亟待开展，当下应加强花生抗渍涝胁迫的研究和治理，以推进花生品种改良创新和指导生产，保证花生产业全面稳定的发展。

分子育种是运用分子生物学技术的科学性与先进性，分离目的基因，构建重组分子，将目的性状基因导入欲改良的植物细胞中，达到培育高产、优质、高抗的新品种，且综合性状优良的后代，育出新品种的目的。分子育种是从基因这个微观水平予以改造和标记，再在植株上进行表达。

非共生血红蛋白近年来陆续在植物当中被发现，研究表明非共生血红蛋白基因能在低氧胁迫时，结合NO作用生成NO₃^-，提升NO₃^-在植物体当中的浓度，满足植物在渍涝缺氧胁迫下对NO₃^-的需求，同时降低NO对植物造成的伤害，从而减轻渍涝低氧胁迫对植物体的伤害。

发明内容

本发明针对现有技术的不足提供以下的技术方案：

花生耐渍涝的非共生血红蛋白基因AhGLB，其全序列为序列表SEQ ID NO：5所示。

花生耐渍涝的非共生血红蛋白基因AhGLB的应用，该基因的表达能够提高花生抗渍涝胁迫的能力。

本发明还涉及利用荧光定量PCR技术检测花生在不同处理条件下所述基因的表达量，包括如下步骤：

设计一对PCR引物：AhGLB-RT-S和AhGLB-RT-AS，提取花生幼叶总RNA，反转录为cDNA，以其为模板，进行PCR扩增，回收扩增产物，将PCR产物与pMD-18连接，然后转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR鉴定后，阳性克隆大量扩增，提取质粒，将取得的质粒依次稀释得到浓度梯度；

利用罗氏荧光定量PCR软件分析并计算出相关的线性方程，作图得标准曲线；

在Roche荧光定量PCR仪进行待测样品的荧光定量PCR，根据程序自动给出的Ct值，对照标准曲线，即可得出所测样品的目的基因拷贝数。

设计不同的处理方式：1)未处理花生不同组织中AhGLB基因的表达分析；2)不同基因型花生在氮诱导下AhGLB基因的表达分析；3)不同基因型花生在低氧胁迫下AhGLB基因的表达分析。

本发明还涉及上述花生耐涝基因在构建载体、转基因以及检测花生耐渍涝状况中的应用，包括如下步骤：

构建AhGLB正义基因植物表达载体PRI101-AN-AhGLB，转化农杆菌EHA105，利用农杆菌侵染法转化花生，经筛选鉴定，获得转基因植株；

设计渍涝缺氧胁迫处理，利用荧光定量PCR技术检测转基因花生及对照根中AhGLB基因的表达量。