[发明专利]转基因油菜RF1品系PCR-DHPLC检测引物及检测方法

说明书

技术领域

本申请涉及转基因产品的检测，特别是涉及一种转基因油菜RF1品系的PCR-DHPLC检测引物及检测方法。

背景技术

目前对转基因油菜的检测方法主要采用常规PCR，实时荧光PCR、PCR-基因芯片等检测方法。传统的常规PCR检测方法在平台扩展方面具有一定的局限性，随着待检目标的增加，需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化，并且兼顾扩增效率等因素，工作量较大；另一方面，通常采用的凝胶电泳分析扩增产物的方法，区分效率不高，检测结果不理想。实时荧光PCR虽然在检测灵敏度等方面较多重常规PCR检测方法有优势，但是由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量扩展，并且检测成本高。常规的多套PCR-基因芯片检测方法，需要多套引物进行扩增，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。变性高效液相色谱技术（Denaturing High-performance Liquid Chromatography，DHPLC）是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，具有分辨率好、扩展性强、灵敏度高等优点。该方法在50℃条件分析样品，样品峰的洗脱只由碱基对的数量决定，样品的碱基对数量不同洗脱顺序也不同，从而产生不同的样品峰。具体的，当过柱的乙腈浓度提高，核酸片段会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。通过得到的洗脱峰与DNA marker比较确定分子量大小，从而判定样品中是否含有目标检测基因。PCR-DHPLC，是将PCR与DHPLC相结合的技术，即先采用PCR扩增出靶标序列，然后再对扩增产物进行DHPLC分析，从而提高检测的灵敏度和特异性。目前，尚没有转基因油菜RF1品系的PCR-DHPLC的检测方法。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于转基因油菜RF1品系的PCR-DHPLC检测的引物，以及基于该引物的转基因油菜RF1品系的PCR-DHPLC检测方法。

为实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请公开了一种用于转基因油菜RF1品系的PCR-DHPLC检测的引物，该引物的上游引物含有Seq ID No.1所示序列，下游引物含有Seq ID No.2所示序列；

Seq ID No.1：5’-GAATTTGGCCTGTAGACCTCAAT-3’

Seq ID No.2：5’-GAAAGAAGGACAGATCATAGGGAAG-3’。

需要说明的是，本申请的引物是针对转基因油菜RF1品系而设计的特异性引物，能够对转基因油菜RF1品系进行特异性扩增，因此，可以理解，该引物除了用于本申请的PCR-DHPLC检测以外，同样适用于常规的PCR检测，以及其它的基于PCR扩增的检测，如实时荧光PCR、基因芯片等等。

本申请的另一面还公开了一种转基因油菜RF1品系的PCR-DHPLC检测方法，该检测方法包括采用本申请设计的引物，以待检测样品的DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增的产物进行变性高效液相色谱分析。

需要说明的是，本申请设计的引物是针对转基因油菜RF1品系的特异性引物，因此，可以理解，如果待检测样品中含有足量的转基因油菜RF1品系成分，即可扩增出相应的靶标片段，并在DHPLC分析时产生相应的洗脱峰。

进一步的，本申请的检测方法还包括以DNA marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与DNA marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。

优选的本申请的检测方法包括如下步骤：

（A）采用本申请的引物，以待检测样品的DNA为模板，进行PCR扩增；

（B）以步骤（A）的PCR扩增产物为样品进行DHPLC分析，同时以DNAmarker为参考标准进行DHPLC分析；

（C）将步骤（B）中PCR扩增产物的DHPLC分析结果与DNA marker的DHPLC分析结果进行比较，确定PCR扩增产物的分子量大小，从而判断是否含有检测的靶标序列。

需要说明的是，理论上，本申请的引物是根据转基因油菜RF1品系设计的特异性引物，能够对待检测样品中的转基因油菜RF1品系成分扩增出约235bp的片段，因此，能够通过DHPLC分析出235bp的洗脱峰；而对其它成分不会有扩增，即不会有其它洗脱峰出现。本申请中，判断是否含有转基因油菜RF1品系的靶标序列的依据即，是否有235bp的洗脱峰。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：