[发明专利]一种快速鉴定核盘菌的分子检测方法

说明书

技术领域

本发明是基于环介导恒温扩增技术(LAMP)对核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的快速分子检测方法，可用于油菜菌核病的病害诊断及病原检测，进行油菜菌核病的流行预测及早期预警。

背景技术

环介导恒温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，具有简单、快速、敏感、特异性强等特点。该技术原理是，根据序列保守区域设计的1对外引物、1对内引物和1对环引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增出产物)时为紫色，阳性(有产物扩增)时为天蓝色。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。该技术在很多方面都优于PCR法，其最大的优点是实现了恒温扩增，不需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程，极大的扩展了LAMP使用的范围。

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病(Rape selerotinia stem rot)是油菜上最重要世界性真菌病害，对油菜产量有很大的影响，常年引起油菜产量减少15％-20％，油菜出油率与品质也会受到严重影响。以LAMP为基础的分子生物学技术是快速检测核盘菌的重要方法之一，该方法简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，从而大大提高了检测效率，为油菜菌核病的流行预测、早期预警及综合防控提供技术指导。然而，经检索目前国内外尚未对核盘菌LAMP快速分子检测的相关报道。

发明内容

本发明的目的是对已有的核盘菌的鉴定及检测方法中存在费时、费力、成本高、准确性低的缺点，提供一种具有简便、快速、省时省力、灵敏度高的鉴定核盘菌的分子检测方法。

本发明所述的快速鉴定核盘菌的分子检测方法，步骤是：

(1)在核盘菌Ssos5(SS1G_14143)基因上设计1对外引物和1对内引物，以核盘菌及其他常见农作物病原菌基因组DNA为模板，利用该引物进行环介导恒温扩增(LAMP)，其中所述的两对引物分别是：

外引物对：

F3：5’-GACTTCGCTACCAAAGATAGCC-3’

B3：5’-AGATCTAGACCCCGGTATCG-3’

内引物对：

FIP：5’-GGCACGGAGAGATGGTAGAGAAGGCCAATCGAATGAAGCTCCCAC-3’

BIP：5’-TCGACCATGACAGCATCTTCTACCCACCAGGTCTTGGTCGTCTG-3’

反应体系：

反应参数：

63℃ 45min，80℃ 10min。

(2)对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3.0％琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果；

(3)鉴定是否为核盘菌菌株；如果LAMP扩增产物显示天蓝色，这时电泳图谱应为梯状条带，判定为核盘菌菌株；如果扩增产物为紫色，这时电泳图谱无条带扩增，判定为非核盘菌菌株(图1)。

本发明采用LAMP技术，设计了两对特异性引物，以核盘菌及其它重要的农作物病原真菌DNA为模板，在水浴锅中进行恒温扩增，扩增产物颜色为天蓝色说明有产物扩增，对应的电泳图谱为梯状条带，颜色为紫色时无产物扩增，对应电泳图谱无条带扩增，因此根据扩增产物颜色变化可直接判定为核盘菌菌株；为油菜菌核病的发生流行规律、早期预警及综合防控提供理论基础和技术体系，提高油菜的产量和质量；对增加生态、社会和经济效益都具有现实而深远的意义。

本发明提供的快速鉴定核盘菌的分子检测方法，具有灵敏度高，所需DNA用量少的特点，与常规PCR检测、RT-PCR检测相比，本发明的有益结果是：

1、简便易行：在实验室采用LAMP技术对核盘菌进行检测，通过恒温水浴锅或者有稳定热源的设备就能进行实验，通过颜色变化就能鉴定出核盘菌菌株，省去了昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程；

2、检测时间短：该检测方法所用检测时间不足1h，而PCR扩增后需要一个电泳检测的过程，这样能大大提供了检测的效率；