[发明专利]犬早孕因子胶体金检测试纸卡及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物医学免疫检测领域，具体是涉及一种检测犬早孕因子的胶体金试纸卡的制备方法和应用。

背景技术

假孕症是犬在繁殖季节常见的一种疾病，多发于3～5岁母犬，是指母犬发情后在未交配或配后没有受孕的情况下，全身状况和行为出现妊娠所特有变化的一种综合征。犬假孕有时伴有子宫疾病，会引起严重的后果，轻则不孕，重则死亡。近年来，随着养犬业和宠物行业的蓬勃发展，母犬假孕的发生率也随之升高，据报道交配假孕率高达50%～75%，这是目前母犬繁殖率低下的一个重要原因，也给养犬业带来了巨大的经济损失。因此，对犬进行早期妊娠诊断可以尽早确定犬是否发生假孕，及时采取复配及治疗措施，以便缩短空怀期。目前多种妊娠诊断方法中B超检测准确率高，但B超确诊受孕要在母犬配种后30天左右，且需要价格昂贵的设备，在犬饲养场及家庭宠物犬主中应用存在困难。如能开发检测快速、灵敏度高、特异性强、使用简便、价格低廉的胶体金试纸卡将具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种犬早孕因子胶体金检测试纸卡及其制备方法和应用，可以临床快速检测母犬早孕因子，用于母犬早期妊娠的临床诊断。

本发明为解决上述技术问题的不足，所采用的技术方案是：犬早孕因子胶体金检测试纸卡，所述检测试纸卡由卡槽和胶体金试纸条组成，卡槽具有一个容置空腔，且卡槽上设置有观察区和加样孔，胶体金试纸条主要由支撑薄片、纤维素膜、含有金标抗体的玻璃纤维膜、载样垫和吸水垫组成，所述的纤维素膜设置在支撑薄片的中部，纤维素膜一侧的支撑薄片上依次粘贴有含有金标抗体的玻璃纤维膜和载样垫，纤维素膜另一侧的支撑薄片上粘贴有吸水垫，所述纤维素膜的中部有一条含有犬早孕因子抗体的检测线和一条含有羊抗兔二抗的质控线，胶体金试纸条设置在卡槽的容置空腔内，卡槽的观察区对应胶体金试纸条的显色区，加样孔对应胶体金试纸条的载样垫。

所述载样垫中金标抗体为兔抗犬早孕因子多克隆抗体。

所述纤维素膜中犬早孕因子抗体为鼠源单克隆抗体。

所述纤维素膜中羊抗兔二抗为羊抗兔IgG抗体。

犬早孕因子胶体金检测试纸卡的制备方法，包括以下步骤：

1）制备含有检测线和质控线的纤维素膜

a、采用体外提取并浓缩的犬早孕因子蛋白作为免疫原以5-10ug免疫Balb/c小鼠，取脾脏细胞与SP2/0瘤细胞进行融合后获得单克隆抗体；

b、采用喷膜机，调整喷液量为30ul/40cm，用包被缓冲液稀释单克隆抗体，浓度为50ug/ml，在纤维素膜中适当位置划线，即为检测线，晾干备用；

c、采用喷膜机，调整喷液量为30ul/40cm，用包被缓冲液稀释羊抗兔IgG抗体，浓度为1mg/ml，在纤维素膜上与检测线平行的位置划线，间隔5mm，即为质控线，晾干得到含有检测线和质控线的纤维素膜；

d、用封闭工作液将步骤c制备的纤维素膜于室温封闭60分钟，取出后置37℃下晾干，封存备用；

2）制备涂覆金标抗体的玻璃纤维膜

    a、采用体外提取并浓缩的犬早孕因子蛋白作为免疫原以10-20ug免疫家兔后采血，提取IgG抗体，制备多克隆抗体；

b、将上述步骤a制备的多克隆抗体置于透析袋中在中进行透析除盐，调整胶体金溶液PH值为9.2～9.5，在电磁搅拌下，以0.2mg/min的滴加速度将抗体溶液逐滴加入胶体金溶液中，然后在电磁搅拌下加入牛血清白蛋白，使溶液中牛血清白蛋白的浓度为1%，即得粗制金标抗体；

c、将粗制的金标抗体以1500r/min低速离心1h，取上清液在4℃温度下以15000r/min的转速离心操作1h，取沉淀以原体积溶于缓冲液中，即得纯化的金标抗体；

d、将纯化的金标抗体均匀喷涂于玻璃纤维膜中，干燥，得到涂覆金标抗体的玻璃纤维膜，封存备用；

3）制备犬早孕因子胶体金检测试纸卡

将涂有检测线和质控线的纤维素膜粘贴在支撑薄片的中部，在纤维素膜的一侧依次粘贴含有金标抗体的玻璃纤维膜和载样垫，在纤维素膜的另一侧粘贴吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成不同宽度的试纸条，将试纸条安放于卡槽中即为犬早孕因子胶体金检测试纸卡。

所述步骤1)中的包被缓冲液为经过0.45u滤膜过滤的0.05M、PH9.6的碳酸盐缓冲液。

所述步骤1)中的封闭工作液为2%牛血清白蛋白、2%脱脂奶粉和0.01M、PH7.0的碳酸盐缓冲液混合后用0.45u滤膜过滤得到的封闭工作液。