[发明专利]一种快速检测食品中致病菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全领域，具体地涉及一种能够快速检测食品中致病菌的检测方法。

背景技术

致病菌是影响食品安全的重要生物因素，目前已经受到消费者和工业生产的广泛关注。和传统的基于培养的方法相比，PCR是检测生命物质的里程碑式发现。PCR技术可以在很短时间内将几个甚至一个目标序列扩增到几百万个拷贝。这样，对于致病菌检测提供了一种可靠、快速、特异的检测方法，理论上说只要存在一个致病菌的目标序列，PCR方法就可以检测出。然而，当把PCR应用于食品样品检测时（比如牛奶），脂肪、蛋白质和其他的食品成分会强烈的抑制PCR反应。虽然PCR反应具有极强的扩增能力，但是它对于抑制物质非常的敏感。

因此，为了有效的除去或者减少抑制物，在PCR之前对食品样品进行预处理是必不可少的。通常增菌培养和分离浓缩是常常采用的方法。对于前者，检测时间大大提高了，因此，后者对于快速检测食品中的致病菌具有很大的潜力。

目前的比较优异的前处理方法是磁性分离技术，其中免疫磁性分离技术研究较多。中国专利201210035468.5、201110143730.3、201210308227.3、201110029946.7、201010550114.5中都是应用免疫磁珠进行分离。然而，致病菌是非常复杂的抗原物质，优质的适合应用的抗体难于制备，有时可能会对于同一种属的一些致病菌不能结合，有时又可能和其他种属致病菌交叉反应。而且从食品样品中分离出致病菌分离率并不高，在此基础上还要提取基因组DNA，进一步增加了损耗。此外，抗体制备困难、成本高，以及在储存和运输过程中易于变性。于是研究者开始试图用其他的生物分子来代替抗体进行致病菌分离，比如IgG、万古霉素和D-甘露糖。然而，迄今为止这些方法尚不能应用于实际食品样品检测当中。

作为另一种选择，一些研究者试图直接用磁性核酸探针从食品样品中分离和浓缩致病菌DNA而并非致病菌本身，但是也存在一些问题，比如，一种捕获磁性探针只能针对一种致病菌，不能同时检测多种致病菌，成本高等。

研究一种可以磁性分离食品中不同致病菌的基因组DNA，而且可以同时分离多种致病菌的基因组DNA，将磁珠与捕获物直接用于PCR检测，将使得食品中致病菌检测更加简便、快速、广泛且成本低廉，对于食品安全的检测是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高、快速、成本低廉、应用广泛的基于非标记的氨基化纳米磁珠捕获痕量基因组DNA结合PCR技术快速检测食品中致病菌的检测方法。主要包括以下步骤：

(1)氨基磁珠的制备

a)制备Fe₃O₄磁性纳米粒子；

b)硅包被Fe₃O₄磁性纳米粒子；

c)去除未被硅包被的裸露Fe₃O₄磁性纳米粒子，得硅包磁珠；

d)氨基化硅包磁珠，得氨基磁珠；

(2)待检样品制备

将预处理后的待检食品样品离心，收集沉淀，将沉淀复溶于缓冲溶液中，加入蛋白酶、表面活性剂以及溶菌酶孵育，后用沸水浴并用酚氯仿抽提得待检样品；

(3)将氨基磁珠与待检样品混合，恒温振荡，磁性分离后洗涤，得吸附有致病菌DNA的氨基磁珠；

(4)将吸附有致病菌DNA的氨基磁珠加入PCR体系中进行PCR检测。

其中所述步骤（1）氨基磁珠的制备中，

步骤a)制备Fe₃O₄磁性纳米粒子所采用的方法为,用共沉淀法将二价铁化合物与三价铁化合物在氨水的催化下共沉淀生成水溶性的Fe₃O₄磁性纳米粒子；

此步骤中的磁性纳米粒子在实际应用中并不仅限于Fe₃O₄磁性纳米粒子，之所以选用，是因为相比而言共沉淀法制备的Fe₃O₄磁性纳米粒子条件温和、价格低廉、绿色环保，而且磁性能也完全可以应用于生物分离应用。

步骤b)硅包被Fe₃O₄磁性纳米粒子所采用的方法为，