[发明专利]用于抑制二化螟生长的利用acy1-CoA desaturase SexiVPAE基因的双链RNA的合成方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及基于RNA干扰技术的二化螟致死基因片段acyl-CoA desaturase SexiVPAE及其dsRNA。 

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是生物体内通过RNA介导的一种特异性的基因沉默机制，其存在于从微生物到植物、动物等大多数真核生物内。RNAi对于生物体调控基因表达、抵御病毒入侵以及维持自身基因组稳定等具有重要意义。RNAi的机制于1998年由Fire等的研究发现。他们的研究表明，外源的双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)可以导致秀丽新小杆线虫体内的同源基因特异性的沉默，这种现象被他们命名为RNA interference(RNAi)。其实在1998年之前人们就多次发现过RNAi的现象，如果Napoli等(1990)在牵牛花中发现的共抑制(co-suppresion)现象，Cogoni等(1994)在粗糙红色链孢霉菌中发现的压制作用(quelling)都属于RNAi。 

利用RNAi机制，人们已经发展出了各种基因沉默的技术，这些技术在功能基因组研究、品种改良以及基因治疗等方面都显示出了巨大的应用前景。研究表明通过人工喂饲外源dsRNA可以特异性的沉默昆虫体内目标基因的表达((Araujo et al. 2006；Turner et al. 2006；Banm et al. 2007；Mao et al. 2007；Walshe et al. 2009)。基于这个原理近年来人们开始尝试利用RNAi机理培育转基因抗虫植物。2007年两个独立的研究小组分别报道了利用稳定表达外源dsRNA的植物喂饲昆虫可以特异性的抑制昆虫体内特异基因的表达，为培育转基因抗虫植物提供了新的思路。Mao等(2007)发现棉铃虫的一个细胞色素P450加单氧酶(cytochrome P450monooxygenases)CYP6AE14对于棉铃虫解除棉花棉酚的毒性起关键作用。他们用表达CYP6AE14基因的dsRNA的转基因拟南芥和烟草喂饲棉铃虫，发现棉铃虫中肠中CYP6AE14的表达量显著降低。棉铃虫中肠上CYP6AE14被抑制可以导致棉铃虫对棉酚的敏感性上升，因此该研究结果可用于发展转基因抗虫棉花。Mao等还用同样的策略特异性的抑制棉铃虫的另一个中肠基因glutathione-S-transferase(GST1)的表达，证明了该策略具有普遍性。Baum等(2007)尝试利用RNAi的策略特异性沉默西部玉米根虫(western corn rootworm，WCR)具有重要功能的关键基因来控制该害虫。通过喂食人工合成的dsRNA12h到1d后，害虫的目标基因的表达显著下降。然而相对于Bt杀虫基因通过RNAi策略来控制害虫的效果相对较慢。一般情况下，利用人工合成的dsRNA喂饲WCR幼虫3天后，其体重开始显著下降。但是，即使是抗虫效果最好的dsRNA片段，喂饲7d也难以观察到明显的致死效果，通常需要 喂饲12d以上才能观察到比较明显的杀虫效果。Baum等利用WCR的V-ATPase基因设计的dsRNA片段转入玉米中高效表达。通过人工接种WCR卵块检测的结果表明，和非转基因的对照相比，转基因玉米显示出对WCR显著增强的抗性。用转基因玉米的根部组织喂饲WCR的幼虫发现其生长被明显抑制。 

因此，利用RNA干扰技术将农业害虫中重要基因的表达进行干扰，会引起害虫的致死或体重下降，从而达到控制害虫的目的。二化螟是水稻的主要害虫之一，由于其危害水稻时会钻入水稻茎杆类，造成喷施农药也对其难以控制。本专利发明就是利用实验室的dsRNA人工喂饲法，从二化螟基因组中筛选出经干扰后能够影响其生长发育的重要基因，为建立利用RNA干扰技术控制害虫的新策略提供序列和数据基础。 

发明内容

根据二化螟acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因的cDNA克隆序列设计相应PCR引物。通过PCR的方法扩增acyl-CoA desaturase SexiVPAE基因的cDNA片段，并在体外转录合成dsRNA。将dsRNA添加到二化螟人工饲料中，用含有dsRNA的人工饲料喂饲二化螟。人工喂饲研究表明，较高浓度的dsRNA可以显著增加二化螟幼虫的死亡率并抑制其生长，该结果为进一步利用该dsRNA序列在生产上有效控制二化奠定了重要基础。 

本发明的具体步骤是：