[发明专利]超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法

权利要求书

1.超强毒传染性法氏囊病毒vvIBDV高免蛋黄抗体制备方法，其特征在于，采集不同地区、不同鸡场疑似传染性法氏囊病鸡病料，进行病原的分离培养、设计一对引物扩增传染性法氏囊病毒vp2基因序列、由于vp2属于其特征性保守序列，能扩增出这段序列即能对其鉴定，利用扩增出来的产物经过电泳、观察，确保扩增出与设计的目的条带大小相符的条带，对含有扩增产物的琼脂糖凝胶回收，测序，同国际和国内已发表的已知序列比对，即可对其分型，分为超强毒毒株、强毒毒株、普通毒株等，最终确定本次分离到的传染性法氏囊病毒毒株属于超超强毒株。

2.如权利要求1所述的超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法，其特征在于，该超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法具体包括病料采集处理及病毒纯化繁殖，vvIBDV-PCR鉴定，步骤如下：

病料的采集处理：从不同地区疑似法氏囊病鸡中采集法氏囊病料；主要选择法氏囊外观水肿呈胶冻样、出血呈紫葡萄状；将法氏囊反复冻融三次，充分释放病毒粒子，增加病毒粒子含量，无菌研磨，再加等体积加入4000IU青霉素、2000IU链霉素/ml的双抗，放入-20℃保存，备用；用琼脂扩散试验检测病毒效价，被检病毒与标准法氏囊阳性血清出现明显的沉淀线，证明法氏囊病毒的存在；

病毒纯化繁殖：法氏囊病毒乳液在鸡胚中繁殖：购买60枚PFS鸡蛋，分三批孵育，每批20枚；将第一批20枚鸡蛋放入温箱中，每日翻蛋2-3次，注意保持湿度；4日后放入第二批，再4日后放入第三批；当第一批鸡胚10日龄时，鸡胚绒毛膜接种法氏囊病毒，0.2ml/枚，接种完毕用熔化石蜡封闭两孔，逐日观察，24h内死亡胚弃去，48h死胚保留，120h死活胚从孵化器中取出，放入4℃冰箱静置，收获内死、活鸡胚绒毛膜和尿囊液；采用琼脂扩散试验方式测法氏囊病毒效价，绒毛膜和尿囊液与标准法氏囊阳性血清都出现明显的沉淀线，效价为2¹；将胚体和绒毛膜无菌取出加PBS缓冲液充分研磨，反复冻融3次后，进行第二次接毒，方法同上，绒毛膜和尿囊液与标准法氏囊阳性血清都出现明显的沉淀线，病毒效价为2³；同样进行第三次接病毒，绒毛膜和尿囊液与标准法氏囊阳性血清都出现明显的沉淀线，病毒效价为2⁶。

3.如权利要求1所述的超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法，其特征在于，该超强毒传染性法氏囊病毒高免蛋黄抗体制备方法包括vvIBDV-PCR鉴定，步骤如下：

引物的设计与合成：根据genbank登录IBDV vp2基因参考序列和表达载质粒pFastBacHTA表达阅读框设计vp2基因扩增引物：

P1：5′-CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC-3′；

P2：5′-CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT-3′；

两头分别引入EcoRI和XhoI酶切位点；

病毒RNA的提取：用Trizol法提取RNA，取250ul病毒液于一普通的1.5ml EP管中，加入750ul Trizol，震荡混匀，静置5min；加入150ul氯仿，震荡混匀，4℃离心，12000r/min，5min；取上清加入450ul异丙醇，颠倒混匀，4℃离心，12000r/min，12min；弃液体，加1ml75％DEPC乙醇洗涤，4℃离心，12000r/min，5min；弃液体，虹吸，干燥沉淀；加9ulDEPC水、，50℃水浴10min，开始反转录；反转录步骤为：10ulRNA、1ul随机引物和4uldNTP混匀，65℃水浴8min后迅速冰浴5min；再加入4ul Buffer、1ul反转录酶和1ul lulRNase inhibitor，37℃水浴2-3h；以反转录产物为模板，，P1和P2为引物进行PCR反应；PCR反应体系：5×Star Buffer5ul，dNTP2ul，4ul模板，P1和P2各0.5ul，Primestar0.25ul，ddH₂O12.75ul；PCR反应条件：98℃预变性10s；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸100s共30个循环，72℃终延伸10min；凝胶电泳以鉴定分子量大小；将PCR产物按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书进行回收；取4.5ul回收产物加入5ul Sollution I和0.5ulVenter，混匀，4℃过夜；将连接产物转化入E.coliDH5α感受态细菌，涂布在用LB配制的1.5％琼脂平皿上，含氨苄青霉素100mg/L，37℃培养14h；挑单菌落接种入含氨苄青霉素100mg/L的LB()，振摇培养12h；提取质粒；质粒用EcoR I和Xho I双酶切鉴定，阳性重组质粒命名为T-VP2；

分离株VP2序列分析及推导氨基酸序列分析：测序结果表明，分离株VP2基因核苷酸长度为1389bp，推导氨基酸序列含有347个氨基酸，采用DNAs tar软件对测序结果进行分析，对照IBDV经典强、弱毒株及超超强毒株高变区氨基酸序列分析分离株VP2分子特征；分离株符合强度株的特征：分离株VP2第328-334位氨基酸序列为S-W-S-A-S-G-S，这与IBDV经典超强毒株VP2七肽区序列相同，超超强毒分子特征为222A、256I、294I和299S本分离株符合256I、294I和299S三个特征，证明本毒株为vvIBDV经典超强毒株。