[发明专利]三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法及基因工程菌株

说明书

技术领域

本发明涉及乙醇的生物制备领域，具体地涉及三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法及基因工程菌株。

背景技术

随着人类文明的不断进步，全球能源问题彰显，现已成为制约全球经济持续稳定发展的重要因素。燃料乙醇是一种清洁、可再生的生物质能源，纤维素燃料乙醇技术原料来源广泛，是一项可持续发展的环境友好型技术，其核心技术体系的建设已成为一个全球能源战略必争之地。木质纤维素分解之后主要转化为葡萄糖和木糖，葡萄糖和木糖在厌氧条件下经酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）发酵生成乙醇。本发明旨在以木质纤维生物质为原料，对经过多重基因改良获得酿酒酵母工程菌株进行发酵获得的纤维素乙醇关键技术进行系统地研究，通过筛选并获得一系列优化的高产和高效率的纤维素乙醇目标菌株，为纤维素乙醇商业化生产奠定技术基础。

木糖发酵时先经木糖还原酶基因XR，木糖醇脱氢酶基因XDH，木酮糖激酶基因XK连续催化生成5-磷酸-木酮糖，然后在磷酸戊糖途径主要基因RPE1,RKI1,TAL1,TKL1催化作用下进入糖酵解途径，最后转化为乙醇。在上述发酵过程中，目前许多研究者对XR进行蛋白工程，例如单突变体XR（K270R）和四突变体XR（K270S/N272P/S271G/R276F），希望通过调节XR的氧化还原水平来提高木糖的消耗速率。有一些研究者对木糖利用代谢途径关键基因XR/XDH/XK/TAL1中的一个或者两个进行不同拷贝的探索，期望更有效的提高木糖和葡萄糖的利用率。

现有技术研究表明木糖乙醇发酵过程中大部分基因的转录水平发生了显著改变，因此转录调控是进一步提高乙醇产量的有效途径。现有基因转录调控技术主要是通过经典的组成型强启动子PGK1和ADH1来介导上述重要的七基因转录，期望提高七基因的表达水平，从而实现纤维素乙醇产量的提高。但上述现有技术改造的酿酒酵母工程菌株发酵木糖时生长速率缓慢，乙醇产量及转化率偏低，乙醇的产量水平在0.36-0.42g/g总糖。

然而，基因转录调控技术带来的基因工程发酵代谢过程中的质粒负担，代谢负担，各种环境压力响应都有可能影响最终的乙醇产量和产率，这是该研究技术的不确定性。同时木糖利用的低消耗速率，低转化速率，尽管研究者尝试了不同的启动子，不同的拷贝数目，不同的微生物菌株背景来源，不同的基因蛋白工程，都没有改变纤维素乙醇技术目前面临的瓶颈和难点。

发明内容

因此为了解决上述问题提出并完成了本发明。

本发明的首要目的是提供三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法。

本发明的另一目的是提供三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的基因工程菌株。

根据本发明的三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法包括通过构建基因XR、XDH、XK、RPE1、RKI1和TAL1的表达质粒，在酿酒酵母中表达上述基因的步骤，其中，用KGD1启动子介导限速基因XK，用HSP26启动子介导关键限速基因TAL1。

根据本发明具体实施方式，所述三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法包括步骤：

（1）将质粒p61转入酿酒酵母WT，得到WXY1，其菌株含有两基因pADH1-RPE1和pPGK1-XDH，质粒p61的构建过程：721bp的启动子克隆进入pbluescript，接下来71bp7的ADH1启动子，434bp的PGK1终止子，410bp的RPE1启动子，629bp（自ATG起629bp）的RPE1结构基因一部分，XDH结构基因，选择标记RKUR，依次克隆进来，形成质粒p61；

（2）将质粒p62转入WXY1，得到WXY2，该菌株额外含有pADH1-XR和pPGK1-XK，质粒p62的构建过程：在上述p61质粒的基础上，500bp的XK启动子替换RPE1启动子，419bp（自ATG起419bp）的XK结构基因一部分替换RPE1结构基因一部分（自ATG），含有四个突变的XR^{K270S/N272P/S271G/R276F}替换XDH结构基因，形成质粒p62；