[发明专利]猪Kobu病毒套式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种猪Kobu病毒的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪Kobu病毒（porcine kobuvirus，PKV）属于小RNA病毒科，嵴病毒属，最先由Reuter G等于2007年2月从匈牙利某猪场健康猪群中采集的60份粪便样品中检测到。已有研究结果表明临床上无腹泻症状的猪群中，PKV的感染率很高；PKV不只局限于肠道感染，还可以造成病毒血症。最近研究表明，PKV与猪腹泻有关，在韩国表现腹泻症状的猪群中普遍存在PKV感染。

Khamrin P等于2009年从日本28个猪场的健康猪群采集了293份粪便样品进行RT-PCR检测，PKV阳性率为45.4%，其中124份阳性样品采集于6月龄以下猪群，9份阳性样品来自6月龄以上猪群。结果表明，日本6月龄以下健康猪群普遍存在PKV的感染。Barry AF等对巴西不同年龄段猪群（哺乳仔猪、保育猪和生产母猪）的115份粪便样品进行了PKV感染率调查，结果阳性率为53%；而荷兰保育猪PKV的阳性率为6.7%。同时，对巴西不同日龄（3d、21d、36d、60d、75d、180d）的猪采集30份血清进行PKV检测，结果检出23份阳性，总阳性率达76.7%。An DJ等发现，无论猪群临床上表现正常或表现腹泻，PKV感染在韩国具有普遍性，其中3周龄以下仔猪群感染率最高。所有研究表明，PKV感染率随着猪年龄的增加而降低。

和所有的传染性疾病一样，确诊猪Kobu病毒病只能通过实验室诊断。由于猪Kobu病毒在BS-C-1、Vero、HeLa、HEL、RD细胞及乳鼠上均不能成功增殖，不能进行病毒分离，目前所有已知的检测猪Kobu病毒的文献中基本都采用普通RT-PCR方法。因此，基于对我国猪群中PKV的流行情况还不清楚的现状，建立一种快速、灵敏、特异性强的检测方法，并使其成为掌握PKV流行病学资料的一个重要手段显得尤其必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服目前对猪Kobu病毒的检测基本都采用普通RT-PCR方法的缺陷，而提供一种猪Kobu病毒套式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，该方法特异性强、灵敏度高，对样品中含微量猪Kobu病毒基因组的检测效果良好，可用于猪Kobu病毒的实验室检测和分子流行病学调查。

本发明提供的技术方案之一是：一种用于检测猪Kobu病毒的套式RT-PCR引物，其包括如下引物：

（1）外向引物P1和P2，其序列分别如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；

（2）内向引物P3和P4，其序列分别如序列表中SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。

本发明提供的技术方案之二是：一种用于检测猪Kobu病毒的试剂盒，其包括如前所述的套式RT-PCR引物。

本发明中，所述的试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录（RT）试剂、猪Kobu病毒阳性对照和阴性对照中的一种或多种。

本发明中，所述的RNA提取试剂可以是本领域常规的提取动物病毒总RNA的试剂，较佳地，所述的RNA提取试剂包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H₂O中的一种或多种；所述的样品裂解液优选Trizol，所述的DEPC-乙醇优选质量百分数为75%的DEPC-乙醇。

本发明中，所述的反转录试剂可以是本领域常规的反转录试剂，较佳地，所述的反转录试剂包括反转录缓冲液、MgCl₂、dNTP、RNA酶抑制剂（RNasin）、随机引物、AMV、反转录酶和DEPC-H₂O中的一种或多种；所述的反转录缓冲液优选10×反转录缓冲液。

本发明中，所述的猪Kobu病毒阳性对照优选猪Kobu病毒阳性样本的cDNA；所述的阴性对照优选H₂O，更优选DEPC-H₂O。

本发明中，较佳地，所述的试剂盒包括：如前所述的引物、RNA提取试剂、反转录试剂、阳性对照和阴性对照。

本发明的一较佳实例为：一种用于检测猪Kobu病毒的试剂盒，其包括：

（1）RNA提取试剂，包括：

样品裂解液管：Trizol750μL；氯仿管：氯仿200μL；75%乙醇管：75%DEPC-乙醇800μL；异丙醇管：异丙醇600μL；DEPC-H₂O管：11μL；以上为适合提取1个样本的总RNA的试剂用量；所述的RNA提取试剂需要4℃保存；