[发明专利]节杆菌ZJB-09277及其在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种新的菌种——节杆菌ZJB-09277(Arthrobacter sp. ZJB-09277)，及利用该微生物选择性拆分3-氰基-5-甲基己酸酯制备普瑞巴林中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。 

（二）背景技术

(S)-3-氰基-5-甲基己酸是合成普瑞巴林的重要手性中间体。普瑞巴林，化学名为(S)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸，是由美国辉瑞公司开发的的γ-氨基丁酸的3位异丁基取代物(Angew Chem Int Ed，2008, 47(19): 3500-3504)。由于普瑞巴林能够有效抑制与神经病理性疼痛、癫痫相关的神经元过度兴奋及神经递质释放增加(Curr Opin Pharmacol，2006, 6(1): 108-113)，已被FDA批准用于带状疱疹后神经痛、糖尿病外周神经痛、癫痫、纤维肌痛等。与传统药物相比，普瑞巴林的剂量更低、服用次数少、副作用小、持续时间长、耐受性强(Curr Med Res Opin， 2006, 22(2): 375-384)，因此被国际疼痛学会(IASP)、欧洲神经病学学会联盟(EFNS)和英国NICE等多个国际指南推荐为一线治疗药物，国内外市场前景十分广阔。 

国内外报道了大量有关普瑞巴林及其中间体合成工艺的文献，可归为手性拆分法、不对称催化法、手性配体法和手性化合物直接合成法等四大类化学合成工艺。由于上述工艺步骤冗长、手性拆分试剂昂贵、反应条件苛刻、有毒有害溶剂用量大，而无法实现规模化生产。生物催化法由于反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点成为最受瞩目的医药及精细化学品合成技术之一。目前，已报道的生物催化合成普瑞巴林手性中间体工艺主要有以下几种： 

Xie等(Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2006, 41: 75–80)以 从Arabidopsis thaliana中克隆得到的重组腈水解酶 AtNit1为催化剂拆分外消旋异丁基丁二腈合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸，ee值高达98%，(S)-3-氰基-5-甲基己酸催化加氢，制得普瑞巴林。Felluga等(Tetrahedron: Asymmetry, 2008, 19(8): 945-955)报道了以异戊醛为原料，在t-BuOK存在条件下与Witting试剂反应，得到α,β-不饱和酸酯。α,β-不饱和酸酯与硝基甲烷发生Michael加成得到外消旋β-异丁基-γ-硝基酯，经Novozyme 435动力学拆分得到S型β-异丁基-γ-硝基酸，最后在酸性环境中氢化还原得到普瑞巴林。Sterimbaum等利用Candida antartica脂肪酶CALB (Candida antarctic lipase B)选择性酯化3-异丁基戊二酸，产物ee为95.5%，再通过化学反应得到普瑞巴林(WO2009158343-A1)。Thijs等在拆分步骤引入猪肝脏酯酶对吡咯酮化合物进行动力学拆分，ee值达到 97%，最后在酸性条件下水解2-吡咯酮得到普瑞巴林(WO2009149928-A1)。辉瑞公司普瑞巴林生产工艺已经更新至第二代，该工艺引入脂肪酶Lipolase催化拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。该手性中间体经脱羧、碱性水解、氢化等步骤制得普瑞巴林(US20050283023)。 

（三）发明内容

本发明目的是提供一株可用于制备光学纯(S)-3-氰基-5-甲基己酸的新菌种——节杆菌ZJB-09277(Arthrobacter sp. ZJB-09277)。其次提供该新微生物在选择性拆分外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。 

本发明采用的技术方案是： 

本发明涉及一种节杆菌ZJB-09277(Arthrobacter sp. ZJB-09277)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号CCTCC NO: M 2012419，保藏日期2012年10月22日。 

该新菌株特征如下： 

菌落形态：30 oC在牛肉膏蛋白胨平板培养24 h，菌落呈圆形，直径2~3 mm，隆起形状为凸镜状，乳白色，边缘整齐，光滑。菌落随时间的延长而增大，数天后直径可达5 mm以上。 

细胞形态：16 h培养物的细胞呈不规则的杆状，0.8~1.2 μm×1.8~8.0 μm。呈V形排列，端圆，无丝状体，无芽孢形成。培养时间延长，细胞逐渐变短，老培养物变成球状。