[发明专利]一种柱转换测定尿液中CEMA和HEMA含量的方法

说明书

 

技术领域：

本发明属于尿液样本的理化检验技术领域，主要涉及尿液样本的巯基尿酸测定技术领域，具体说是一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪测定尿液中N-乙酰基-S-（2-腈基乙基）-L-半胱氨酸（CEMA）和N-乙酰基-S-（2-羟基乙基）-L-半胱氨酸（HEMA）含量的方法。

 

背景技术：

丙烯腈是含有活性乙烯基和腈基的a,b-不饱和腈类化合物。它可以通过代谢活化后形成活性更强的环氧型中间体，进一步与体内的细胞大分子的亲核中心共价结合，从而造成机体的损伤。体外毒理学实验和流行病学调查数据显示，丙烯腈具有一定的致癌性。1999年，IARC将其归为可能的人类致癌物。丙烯腈存在于卷烟烟气中（7.8-39.1 μg/支烟），普通人群可以通过吸入卷烟烟气接触丙烯腈，从而增加健康风险。丙烯腈进入体内后于可以直接或通过代谢活化后于GSH，形成两种巯基尿酸代谢物：CEMA和HEMA。尿液中的CEMA和HEMA不仅能提供丙烯腈及其可能的代谢中间物及其与GSH结合机制的有关信息，而且能在一定程度上反映丙烯腈在体内的代谢状况。2007年，Scherer等研究了CEMA和HEMA等生物标志物与抽吸卷烟原型物释放量之间的关系，用于评估接触风险。

柱转换LC-MS/MS方法是近年来发展起来的一种在线前处理并检测尿液中代谢物的方法。较早就有研究者将其应用于检测尿液中低含量的羟基多环芳烃（OH-PAH）类化合物，此方法采用的一个修饰的多孔硅胶填充柱在线前处理尿液样本，纯化后的分析物用HPLC检测，实现了低含量的羟基多环芳烃的在线检测。但是定制色谱柱的价格昂贵，并且此方法还需要一个液固萃取过程来净化尿液样本，不能实现完全的在线分析。

Simon等改进了上述的柱转换方法，使用一套柱转换-HPLC检测了尿液中的3-羟基苯并[a]芘，此系统包含四个六通阀和三个预处理小柱，来回切换来实现样品的在线净化与富集。此方法虽然实现了尿液样本的在线纯化与富集，但是系统过程复杂，较多的前处理小柱处理样本会降低方法的回收率。2008年，Schettgen将柱转换方法与串联质谱联用，应用于检测尿液中的苯巯基尿酸。此方法选取了一种较为新颖的限进色谱填料小柱，由于此小柱兼具体积排阻色谱和反相色谱的功能，能够较好的除去尿液基质的大分子物质和水溶性盐类，从而降低基质效应，提高灵敏度。2009年，Schettgen应用此方法同时检测尿液中的CEMA和1,3-丁二烯的两种巯基尿酸代谢物。此方法虽然能够在线的检测尿液中的CEMA，但是方法的定量限为1 ng/mL，不能满足普通人群尿液中CEMA含量的检测（<1 ng/mL）,并且此柱转换方法需要添加一个独立的单元泵，用于进样和纯化样品流动相，而此单元泵不但价格昂贵，且不能由质谱软件同步控制。

发明内容：

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种采用柱转换LC-MS/MS测定尿液中CEMA和HEMA含量的方法，该方法能快速、准确检测尿液中CEMA和HEMA的含量，测定结果准确、测定干扰少。

本发明建立了一种改进的柱转换-LC-MS/MS方法测定尿液中的CEMA和HEMA，该方法无需额外的独立单元泵，整个仪器系统和分析过程由Analyst操作软件同步控制。方法灵敏度高，可以有效的除去大分子蛋白，降低基质干扰。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：尿液中CEMA和HEMA含量的测定方法，包括以下工艺步骤：

a、收集志愿者尿液。

b、样品前处理：尿液在室温下解冻，混合均匀。准确移取0.5 mL的尿液，加入20 μL的甲酸和10 μL混合内标，加入470 μL的50 mM的甲酸铵水溶液（甲酸调节到pH=2.5），混匀后在10000 rpm的条件下离心5 min。取上清液过0.22 μm的聚醚砜水相滤膜，进LC-MS/MS分析。

c、利用甲醇配制不同浓度的标准工作溶液；

d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的CEMA和HEMA标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，CEMA的线性回归方程为y =0.0372x +0.0489, HEMA的线性回归方程为y = 0.0291x + 0.0144，其中Y代表分析物与内标峰面积的比值，X表示尿液中目标分析物的浓度。相关系数大于0.999，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

在本发明中，所述混合内标为氘代内标，氘代内标浓度为1 μg/mL。