[发明专利]同时检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒的方法及专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒的方法及专用引物。

背景技术

樱桃是经济价值很高的果品之一，但是容易受病毒的为害。至今已发现68种侵染樱桃的病毒，其中苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）和李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）危害较为严重。近年来，由于不断从国外大量引进樱桃种子和苗木新品系以及国内不同地区苗木和种子的频繁调运，加快了病毒的传播。李春敏等（1997）利用PAS-ELISA检测出昌黎地区甜樱桃ACLSV的感染率为47.1%。牛建新等（2003）用RT-PCR检测出了库尔勒香梨上的ACLSV。李青等（1996）利用ELISA法对北京地区的桃、樱桃携带PNRSV的情况进行了检测；阮小凤等（1998，2004）对陕西省甜樱桃、桃上的病毒病的发生情况进行了ELISA检测，发现在这两种果树上，PNRSV、PDV、ACLSV的发生率较高，之后用改良RT-PCR对樱桃PDV和PNRSV进行了检测。侯义龙等（2005，2006）应用RT-PCR检测桃和樱桃及起组培苗上的PNRSV，调查大连市甜樱桃品种‘红灯’的田间植株时发现被检植株PNRSV的感染率达100%。

发明内容

本发明的目的是提供一种辅助检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒的方法及专用引物。

本发明所提供的用于检测植物病毒的引物，为引物对甲和引物对乙；

所述引物对甲为检测苹果褪绿叶斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No.1所示，另一条引物序列如SEQ ID No.2所示；

所述引物对乙为检测李属坏死环斑病毒的引物对，一条引物序列如SEQ ID No.3所示，另一条引物序列如SEQ IDNo.4所示。

所述植物病毒可为所述苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒。

本发明所提供的辅助检测樱桃是否感染苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒的方法，包括如下步骤：以待测樱桃的叶片的反转录cDNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物为大小分别为632bp和455bp的两个条带，则待测樱桃候选为同时感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒；若所述PCR扩增产物仅为大小为632bp的条带，则待测樱桃候选为感染苹果褪绿叶斑病毒；若所述PCR扩增产物仅为大小为455bp的条带，则待测樱桃候选为感染李属坏死环斑病毒；若所述PCR扩增产物中无大小分别为632bp和455bp的两个条带，则待测樱桃候选为没有感染苹果褪绿叶斑病毒和李属坏死环斑病毒。

上述方法中，所述用引物对进行PCR扩增的方法为：先用引物对甲进行PCR扩增，10个循环后，再加入引物对乙继续进行PCR扩增，直至扩增结束。

上述方法中，所述PCR扩增的反应体系中每条引物的浓度为0.5μM；所述PCR扩增的退火温度为57℃。

含有上述引物的用于检测苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒植物病毒的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。

上述引物或上述试剂或上述试剂盒在检测苹果褪绿叶斑病毒和/或李属坏死环斑病毒植物病毒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明中所建立的多重RT-PCR可以同时检测出生产中樱桃ACLSV和PNRSV病毒复合侵染现象，比单一RT-PCR节省时间；操作上也更为简单；此外，也减少了试验中所消耗的药品，更为经济。当反转录体系中的带病植株的总RNA量为10^-4μg时，经过PCR扩增后，仍可以同时检测到两种病毒。

附图说明

图1为CTAB法提取樱桃叶片RNA电泳。1-4：‘红灯’、考特、Chelan、F8。

图2为ACLSV、PNRSV病毒引物AF1/AR1和PF/PR‘红灯’叶片的PCR预扩增。A：ACLSV；B：PNRSV；M：D2000DNA分子标准量。

图3为ACLSV、PNRSV病毒引物AF2/AR2和PF/PR在不同退火温度下PCR扩增‘红灯’樱桃叶片电泳。A：ACLSV；B：PNRSV。M:2000bp DNA分子标准量;1-6分别为45℃、48℃、51℃、55℃、57℃和60℃；A：引物AF2/AR2；B：引物PF/PR。