[发明专利]适用于检测泡型包虫病抗体的囊型包虫病囊液脱酯抗原及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及人和动物泡型包虫病抗体检测技术领域，是一种适用于检测泡型包虫病抗体的囊型包虫病囊液脱酯抗原及其制备方法。 

背景技术

泡型包虫病(Alveolar echinococcosis, AE)是由多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)的幼虫寄生引起的人兽共患病，早期无明显症状,发现时病灶多已扩散,病灶呈渐进性浸润增长,超声波和CT检查等常规的诊断方法不易与肿瘤病灶区别，血清学检测有助于AE的确诊。检测包虫病抗体是诊断包虫病的重要指标，抗原是影响检测特异性和敏感性的关键试剂。盐析、离子层析、亲和层析、制备电泳等方法，包虫原头节、囊壁、囊液等材料，都曾用于提取和纯化检测包虫病抗体的抗原；近年来，基因工程技术和人工合成多肽也在制备抗原中应用，曾用于检测包虫病抗体研究的抗原种类繁多，均未能显著提高检测包虫病抗体的特异性和敏感性。囊型包虫病(Cystic echinococcosis，CE)是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosur.Eg)的幼虫寄生引起的人兽共患病，检测CE抗体的方法，AE抗体也出现阳性反应，提示Em、Eg的原头节或囊液中存在相同或相似反应性的抗原成分，CE囊液中可能有适用于检测泡型包虫病抗体的抗原。常规方法提取CE囊液抗原，不仅程序复杂，收获量甚少，而且与多种寄生虫有交叉反应。酶联免疫吸附试验间接法一种酶标第二抗体只能检测一种动物的抗体，检测多种动物包虫病抗体，必需制备多种动物血清免疫球蛋白的酶标第二抗体，不仅工作量大，而且受酶标第二抗体效价差异的影响，很难用于比较不同种动物抗体含量，双抗原夹心法检测抗体，酶标记抗原替代第二抗体，可检测多种动物的抗体，为人兽共患病调查和疫情监测提供便利条件。 

发明内容

本发明提供了一种适用于检测泡型包虫病抗体的囊型包虫病囊液脱酯抗原及其制备方法，克服了上述现有技术之不足，其能提高检测泡型包虫病抗体的特异性、敏感性和稳定性，用途广。 

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种适用于检测泡型包虫病抗体的囊型包虫病囊液脱酯抗原，按下述步骤得到： 

第一步，采集绵羊囊型包虫病包囊液，在包囊液中加入固体硫酸铵溶解，使包囊液中硫酸铵的浓度达到饱和浓度的30％，用氢氧化钠或氢氧化铵调节至pH 7.2，然后按调节pH后液体体积的30％至50％的量加入氯仿或石油醚，剧烈振荡成混悬液，混悬液静置至氯仿或石油醚与包囊液分层，再剧烈振荡并静置分层2次，然后4000g离心20min后，弃沉淀和氯仿或石油醚，收集处理后的包囊液；

第二步，在第一步处理后的包囊液中加入固体硫酸铵溶解，使处理后的包囊液中硫酸铵浓度达到饱和浓度的50％至70％，用氢氧化钠或氢氧化铵调节至pH 7.2，在温度为4⁰C至10⁰C的冰箱中放置4h，然后4000g离心10min后收集沉淀物，弃上清液；

第三步，将第二步收集的沉淀物加入到20倍沉淀物体积量的硫酸铵溶液中，硫酸铵溶液的pH 为7.2，硫酸铵的浓度为饱和浓度的50％至70％，振荡使其成为混悬液，然后4000g离心10min后，收集沉淀物，弃上清液；

第四步，将第三步收集到的沉淀物加入到20倍沉淀物体积量的硫酸铵溶液中，硫酸铵溶液的pH 为7.2，硫酸铵的浓度为饱和浓度的50％至70％，振荡使其成为混悬液，然后4000g离心10min后收集沉淀，弃上清液，在收集到的沉淀物中加入10倍沉淀物体积量的蒸馏水，振荡使沉淀物溶解后，加入与沉淀物溶解后溶液等体积量的氯仿或石油醚，剧烈振荡成混悬液，静置至氯仿或石油醚与溶液分层，再剧烈振荡并静置分层2次，收集水溶液；

第五步，将第四步收集的水溶液装入透析袋中，将透析袋放入生理盐水中，生理盐水的体积为透析袋中水溶液体积的20倍，在温度为4⁰C至10⁰C的冰箱中进行透析12h至24h，其间换生理盐水3次，每次更换生理盐水体积为透析袋中水溶液体积20倍，透析完成后，透析袋中的溶液4000g离心20min，弃沉淀，收集上清液，上清液即为适用于检测泡型包虫病抗体的囊型包虫病囊液脱酯抗原。

本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种适用于检测泡型包虫病抗体的囊型包虫病囊液脱酯抗原的制备方法，按下述步骤进行：