[发明专利]cccDNA标准品及其制备方法、定量检测乙肝病毒cccDNA的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种cccDNA标准品及其制备方法、定量检测乙肝病毒cccDNA的方法及试剂盒。

背景技术

乙肝病毒（HBV病毒）感染宿主后，HBV病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入宿主细胞细胞核形成的共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子基因组，该共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子能形成环状的DNA结构，称为共价键密闭环状DNA(cccDNA)。cccDNA是乙肝病毒的复制“池”，对cccDNA的准确定量能辅助对乙肝病毒的诊断。

cccDNA和rcDNA在结构上有很大不同：rcDNA在正链与负链上均有缺口或缺刻，只是部分区域互补故能形成环状结构，但非超螺旋结构；而cccDNA两条链均是完整的，二者共价互补，形成超螺旋结构（Nassal,M.(2008).″HepatitisB viruses:Reverse transcription a different way."Virus Research 134(1-2):235-249）。由于缺口或缺刻的存在，rcDNA可以被一些核酸酶如外切核酸酶Ⅲ、绿豆核酸酶等降解成寡核苷酸或单核苷酸，而cccDNA则由于是超螺旋且双链结构均是完整的，一般不会被上述酶降解。上述差异是设计和建立cccDNA检测技术的基础。

cccDNA的定性检测：既往绝大多数文献报道的是用Southern blot对cccDNA进行定性检测，但技术要求较高，敏感度低。近年来，PCR技术对cccDNA进行检测的技术得到发展。由于PCR技术灵敏度极高，rcDNA和cccDNA的序列又具有高度的同源性，因此在用PCR技术检测cccDNA时，必须确保只能扩增cccDNA而rcDNA不被扩增。目前利用rcDNA和cccDNA结构上的差异可以解决这一问题。由于rcDNA的正链和负链上均存在缺口，故可以设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA不会被扩增，而cccDNA由于是完整的双链结构则可以被选择性扩增。

cccDNA的定量检测：在定性检测的基础上，可以进一步对cccDNA进行定量检测。He等建立了实时荧光定量PCR检测cccDNA的方法（Mark A Kay，Cheng-Yi He&Zhi-YingChen.(2010).″A robust system for production of minicircleDNA vectors."Nature Biotechnology 28(12):1287-1289），他们将TaqmanMGB探针设计在负链缺刻的下游，与负链互补结合。对cccDNA，在上游引物的引导下，Taq酶到达TaqmanMGB探针所结合的位点，利用其5’→3’外切活性将探针切断，3’端的淬灭基团失去对5’端的发光基团的抑制作用，从而产生荧光信号。每扩增一个cccDNA分子，就会产生一个荧光信号，PCR仪可对产生的信号进行实时监测，根据荧光信号的强弱对cccDNA进行定量。

目前最常用的定量检测cccDNA的方法是实时荧光定量PCR检测cccDNA。如图1所示，该方法由一对跨rcDNA双缺口的特殊引物和一个荧光探针实现。正义引物P1与负链互补结合，位于正链缺口上游，反义引物P2与正链互补结合，位于负链缺口下游，rcDNA因为存在缺口而不被扩增，cccDNA则能被选择性的扩增。在cccDNA负链缺口下游加入一个与负链互补的荧光探针，可实现荧光定量PCR对cccDNA的定量分析。但是，由于cccDNA阳性标准品获得困难，多为PCR扩增得到的cccDNA线性双链片段，其构象、链间作用力等理化特征与天然的cccDNA相差甚远，从而对荧光定量PCR过程和结果造成影响，使得cccDNA的定量不能精确。

发明内容

基于此，有必要提供一种cccDNA标准品及其制备方法、一种使用该cccDNA标准品的定量精确的定量检测乙肝病毒cccDNA的方法及试剂盒。

一种cccDNA标准品，所述cccNDA标准品包括一个单位的HBV基因组DNA和一个重组位点attR。

一种cccDNA标准品的制备方法，包括如下步骤：

首先将一个单位的HBV基因组DNA连接到含有重组位点attB和attP的微环制备载体上，接着采用微环DNA制备技术，attB和attP重新组合后形成attR，从而制备出HBV微环DNA，该HBV微环DNA即为所述cccDNA标准品。

在一个实施方式中，所述微环制备载体为微环制备载体ZY781。

一种定量检测乙肝病毒cccDNA的方法，包括如下步骤：