[发明专利]人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法，属于生物制品制备技术领域。 

背景技术

狂犬病是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病死亡率为100%。卫生部2009年、2010年全国法定传染病报告发病、死亡统计表中，狂犬病的死亡率第一，死亡数第三，狂犬病已成为我国最严重的公共卫生问题之一。 

为满足我国国内市场的需求，国内很多厂家都在生产狂犬疫苗，主要包括原代地鼠肾细胞、原代鸡胚细胞和Vero传代细胞疫苗。这些疫苗都存在异源蛋白，外源因子，DNA污染等各种不同的风险因素。人二倍体细胞狂犬病疫苗目前只在欧洲有上市，如美国Wyeth厂，法国Sanofi Pasteur厂和德国Behring厂生产的二倍体疫苗，通过几十年的市场销售，已证实具有良好的免疫原性和安全性，这得益于生产工艺的稳定。 

国内目前狂犬病疫苗主要为灭活疫苗，灭活疫苗已失去对机体的感染力，但仍保持其免疫原性，可以刺激机体产生相应的免疫力，抵抗野毒株的感染，灭活疫苗免疫效果良好。灭活剂主要为福尔马林和β-丙内酯，但是福尔马林对狂犬病毒有持续的灭活作用，导致疫苗效力不断下降，而β-丙内酯灭活的疫苗经37℃作用后能完全水解，所以保持交苗效力的相对称定，国内目前狂犬病毒疫苗灭活工艺，采用超滤浓缩后加入β-丙内酯4℃灭活24h后水解灭活剂，工艺较粗略，对灭活过程较少监控，只在灭活完成后进行灭活效果验证，存在灭活过程的 不确定性，给大规模化的生产带来未知性，也对终产品的放行具有潜在危险因素。本方法不止在灭活前对技术参数确认，并且在灭活过程中进行灭活效果监控，灭活后进行灭活效果验证试验，通过在灭活步骤增加过滤及转移，以及对灭活条件参数的确定，达到最终生产出的灭活疫苗安全性。 

发明内容

本发明目的是提供一种人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法。 

本发明提供的人二倍体狂犬病疫苗病毒液的灭活方法，包括以下步骤： 

（1）浓缩人二倍体狂犬病疫苗病毒液，浓缩倍数为10～20倍，获得病毒浓缩液； 

（2）添加灭活剂β-丙内酯，搅拌； 

（3）灭活病毒液的转移；包括两次灭活病毒液的转移，第1次是将添加了灭活剂并搅拌后的病毒液转移至另一容器，第2次是将第1次转移后的灭活病毒液继续搅拌灭活，然后再转移到无毒区的容器中； 

（4）水解去除灭活剂。 

其中，步骤（1）浓缩病毒液的方法是将人二倍体狂犬病疫苗病毒液经3～6μm的过滤器和0.8μm的过滤器过滤，再进行超滤浓缩. 

所述的超滤浓缩是采用10KB的超滤膜包进行超滤。 

超滤浓缩前，用不含人血白蛋白的冲洗液平衡超滤膜包，膜包平衡后的回流液的pH值为6.0～8.0。 

所述的冲洗液为BME液，含质量百分比0.02%谷氨酰胺，24.63%碳酸氢钠。 

进一步，本发明灭活方法中，步骤（1）还包括将超滤浓缩后的浓缩液先后经3～6μm的过滤器和0.45μm的过滤器过滤。 

本发明的狂犬病病毒液浓缩液存放于2～8℃不超过30天。 

本发明实施例中所用的人二倍体狂犬病疫苗病毒液是在人用二倍 体细胞上接种狂犬病病毒株得到的狂犬病病毒收获液。所述的人用二倍体细胞可以为KMB-17、WI-38、MRC-5、2BS中的一种。优选地，本发明所述的狂犬病病毒为狂犬病病毒固定毒PM-1503-3M（简称PM株）。在本发明的实施例中，所用的人用二倍体细胞为MRC-5。 

进一步地，步骤（1）获得的浓缩病毒液中人血白蛋白的浓度为40～60mg/ml，浓缩液的pH值为7.0～9.0，10～15℃下平衡。 

更进一步地，步骤（1）获得的浓缩病毒液中人血白蛋白的浓度为45～55mg/ml，浓缩液的pH值为7.5～8.5。 

本发明方法中，步骤（2）添加添加灭活剂β-丙内酯的方法是：先将β-丙内酯用灭菌水1：40倍稀释，再以体积比1:100添加到浓缩病毒液中。 

其中，步骤（2）搅拌条件为10～15℃下，155～180r/min。 

其中，步骤（3）中在灭活剂添加后的第50～70min时，进行第1次灭活病毒液的转移；病毒液转移入另一容器后继续搅拌，待添加灭活剂后的第600min～700min时，将灭活液转移到无毒区的容器中继续搅拌灭活至灭活剂添加后的第1400～1500min。