[发明专利]新型抗狂犬病毒糖蛋白人源基因工程抗体的制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及抗狂犬病毒糖蛋白人源基因工程抗体的制备与应用。具体地，本发明涉及抗狂犬病毒糖蛋白G的单链抗体的制备与应用。 

背景技术

狂犬病，是由狂犬病毒感染引起的人畜共患急性传染病。狂犬病潜伏期可以从几天至数年，病情极为凶险，病死率高达100％。人类狂犬病主要是通过患狂犬病动物的咬伤、抓伤或被动物舔了破损的黏膜引起的感染，传染源极为广泛，主要传染源为犬，其次为猫，因此预防控制难度大。目前，全球狂犬病病例接近5万，主要分布在亚洲。我国几乎各省都有狂犬病的病例发生。上个世纪从70年代至80年代初，由于我国对犬的控制措施不力和疫苗供应严重不足，造成狂犬病病例每年持续高达5000-7000人之多。此后全国各地加大了对犬的管理力度，且细胞疫苗大量生产确保供应，使狂犬病的疫情逐年下降，到1996年降至159例。但是，1997年开始回升到222例，此后每年以高比例的速度快速回升。其主要原因是进入90年代中期后，我国城市居民喜欢将犬、猫作为宠物引入家庭，加之对家养动物的许多管理制度和措施不够完善，使狂犬病疫情逐年回升，居高不下，2008年2373人死于狂犬病、2009年2131人死于狂犬病，至今全国狂犬病病死率仍居法定传染病前列。 

到目前为止，疫苗和抗体仍然是预防与治疗狂犬病的最有效的手段。而在暴露后治疗中，在疫苗刺激肌体产生有效的保护之前，被动免疫血清或抗体显得尤为重要。狂犬病暴露后预防，WHO推荐的处理方法是全程注射狂犬病疫苗，同时注射抗狂犬病马血清(ERIG)或抗狂犬病人血清(HRIG)。国外的代表性产品是法国巴斯德的ERIG PMC和IMOGAM RABIES-HT；Bayer公司生产的BayRab(HRIG)。在国 内有国药成都生物制品研究所与武汉生物制品研究所生产的ERIG，血液制品生产企业有一定量的HRIG。 

但是，抗狂犬病人血清的生产因为血源受限制价格昂贵，产量有限，并且人免疫球蛋白也存在潜在血源携带病原体的可能性。马血清制品比较容易发生严重的超敏反应，虽然巴斯德在降低马血清的过敏原性方面做了一些工作，包括在制备过程中加入纯化与病毒灭活步骤，但是超敏反应也还时有发生。 

国际国内的研究表明，有必要用单克隆抗体取代狂犬病毒暴露后使用的血源抗体。1990年，B.Dietzschold利用细胞融合技术制备多株人单克隆抗体，发现一株能特异结合狂犬病毒G蛋白的抗体Mab57，其能高效广泛地中和狂犬病毒并且对狂犬病毒攻击的实验室啮齿类动物有保护作用(J Virol.，1990，64(6)：3087-3090)，针对的是狂犬病毒蛋白G的226-231位氨基酸序列。另外，马萨诸塞大学与美国疾病预防控制中心共有的美国授权专利7,727,532(对应中国专利申请CN101133158A)还公开了人抗狂犬病单克隆抗体17C7株，其在印度已经进入II期临床。17C7株单抗是针对狂犬病毒蛋白基因的336-342位氨基酸序列。 

为了大量制得单克隆抗体，B.Dietzschold等将Mab57基因转入SPBN重组病毒表达系统，在BSR细胞中制备了SO57抗体(J ImmunolMethods，2001，252(1-2)：199-206)。但该方法的稳定性差，操作烦琐，难以实现产业化。因此需要大规模生产单克隆抗体。 

另外，用哺乳动物细胞生产单克隆抗体的生产过程染菌风险大、难以形成大规模生产。培养过程添加的血清也是潜在的污染源，无血清培养基价格昂贵。尽管人源单克隆抗体相对比较安全，但是由于不同人群的抗体有同种型的差异而且是150KD的分子量相对较大的蛋白，有针对单克隆抗体产生免疫反应的可能，从而降低单抗的治疗效果(J MAbs.2009：332-338)。再者，单克隆抗体的全抗体有Fc片段，作检测试剂有非特异性吸附，产生的本底高。 

因此，需要开发一种能大规模生成、经济实惠且安全有效的狂犬病治疗制剂。 

发明内容

本发明人意外地发现，通过用原核细胞例如大肠杆菌表达人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体，可以实现该单链抗体的高效表达，表达产物具有很高的中和狂犬病毒糖蛋白的活性，从而为大规模、经济且安全地生产狂犬病毒诊断剂、狂犬病治疗剂和/或预防剂提供了另一种途径。