[发明专利]一种座壳孢次生代谢产物的提取方法

说明书

  

技术领域：

本发明涉及一种座壳孢次生代谢产物的提取方法。

技术背景： 

座壳孢（Aschersonia）是虫生真菌的重要成员，隶属于子囊菌门、粪菌纲、肉座菌目、麦角菌科。座壳孢孢子具有杀粉虱活性，并有商品化的制剂。经研究其代谢产物也具有杀粉虱、蚜虫等的活性，而且由于代谢产物不受温度、雨水等环境因素的影响，因此具有潜在的应用价值。不仅在农药方面有一定的应用价值，在医药方面也具有潜在的开发价值，已研究座壳孢代谢产物在抗结核杆菌、疟原虫、肿瘤细胞等方面也有一定的活性，所以若要大规模提取应用，首先要考虑提取方法的优化。

发明内容： 

本发明的目的提供一种优化座壳孢次级代谢物的提取方法，用该方法提取的次级代谢物质量多，种类丰富，为大规模生产次级代谢物提供了参考条件。

本发明提供了一种座壳孢次生代谢产物的提取方法，所述方法的具体步骤为： 

1) 初级、次级培养：座壳孢菌（邱君志等，昆虫病原真菌粉虱座壳孢对烟粉虱侵染行为的初步研究. 菌物学报,2004，23(1):115～121）活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在130~160r/min、24~28℃条件下连续培养7~10天即初级培养，按8％~10％接种量再次转接到PDB培养基中，在24℃~28℃条件下静止培养35~40天即得次级代谢产物；

2) 冷浸提取：菌液与菌丝体过滤分离，菌丝体在3℃～12℃的有机溶剂中浸泡48～100小时，过滤得浸泡液，旋蒸温度控制在35℃～40℃得浸膏，回收有机溶剂；

3) 摇瓶萃取：加水溶解浸膏，水与浸膏重量比为50:1～100:1，将水溶物倒入分液漏斗中，加入1～2倍的乙酸乙酯进行摇瓶萃取，摇瓶转速为150r/min～280r/min，摇20～60min后静止100min～200min，取乙酸乙酯部分，旋蒸浓缩得到粗提物，回收乙酸乙酯。

  

所述PDB培养基的制备为：200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L。

更优选的，所述步骤2)菌丝体在4℃～10℃的有机溶剂浸泡48～72小时。 

所述步骤2)中的有机溶剂为丙酮、乙醇、甲醇中的任一种。 

更优选的，步骤3) 所述的摇瓶萃取条件为200～250r/min摇20～40min后静止100～150min。 

步骤3)所获得的粗提取物通过GC-MS（气相色谱质谱联用）检测。 

本发明的显著优点： 

本发明提供了一种优化座壳孢次级代谢物的提取方法，用该方法提取的次级代谢物质量多，种类丰富，且应用GC-MS进行检测物质更精确，为大规模生产座壳孢的次级代谢物提供了参考条件。

附图说明

图1为实施例1 座壳孢菌挥发性成分GC-MS总离子流图谱； 

图2为实施例2 座壳孢菌挥发性成分GC-MS总离子流图谱；

图3为实施例3 座壳孢菌挥发性成分GC-MS总离子流图谱；

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明，但是本发明不限于此。 

以下各实施例中PDB培养基的制备为：200g马铃薯，20g葡萄糖，沸水煮30min，经4层纱布过滤后加单蒸水定容至1L。 

实施例1：

1) 座壳孢菌活化后，取菌块接种到PDB培养基中，在130r/min、24℃条件下连续培养7天即初级培养，按8％接种量再次转接到PDB培养基中，在24℃条件下静止培养35天即次级代谢产物。

2) 菌液与菌丝体过滤分离，将菌丝体在3℃、甲醇中浸泡48小时，过滤得浸泡液，温度在35℃下旋蒸浓缩得浸膏，回收甲醇。 

3) 加水溶解浸膏（水：浸膏重量比＝50:1），将水溶物倒入分液漏斗中，加入1倍的乙酸乙酯进行摇瓶萃取，摇瓶转速为150r/min摇60min，静止100min，取乙酸乙酯部分，旋蒸浓缩得粗提物，回收乙酸乙酯。