[发明专利]一种多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法。

背景技术

在许多研究领域，包括遗传连锁图谱构建、QTL或基因定位、基因图位克隆、系统演化、分子进化、分子标记辅助育种、遗传多样性分析、亲缘关系鉴定等，都涉及大量的分子标记分析，这往往是一个实验室无力而且也不可能独立承担的。因此，要求发展高通量的分子标记。高通量分子标记是指在单位时间和处理中能提供大量遗传信息的分子标记。而自动化分析是高通量分子标记技术发展的基础，多重点样就是将多个聚合酶链式反应产物上样同一电泳道来增加信息量，是自动化分析的重要方面。

目前，广泛用于植物分子标记检测的电泳技术包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳，他们通过比较目标分子标记PCR扩增条带在凝胶上的迁移距离，获得不同个体（不同基因池）间在目标分子标记座位上的长度多态性。聚丙烯酰胺凝胶电泳虽然分辨率较琼脂糖凝胶电泳高一些，但需要进行玻璃板的清洗、晾干（吹干）、凝胶配置、灌胶、凝固、电泳、染色、显色等多个步骤，整个过程约需要4~5小时。即使研究者在不断改进聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，但仍然存在制胶难度大、步骤多、时间长、体力投入大等缺点。

琼脂糖凝胶的亲水性强、理化性质稳定且制备非常简单（配制时只需称取一定量的琼脂糖粉，再加入一定量的电泳缓冲液，在微波炉中加热充分溶解后冷却至50~60度，加入溴化乙锭染色剂混匀，灌入凝胶模具，很快凝固即可电泳）成为分离、鉴定、纯化DNA片段最为简单和重用的方法之一。琼脂糖凝胶制作简单，在实验室中，通常一次点样电泳结束、凝胶成像系统记录电泳结果后就被丢弃了。这种做法一方面造成了琼脂糖粉末和电泳缓冲液的大量浪费，显著增加了分析测试的成本。另一方面，凝胶制备中用的EB是一种强致癌物质，一次点样并不能充分利用凝胶中的EB，造成了EB不必要的向环境中释放。因此，提高单位面积上EB的利用率，减少制胶量，优化琼脂糖凝胶电泳方法是一个值得关注的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有微卫星DNA电泳检测时造成琼脂糖粉和电泳缓冲液大量浪费，以及EB的利用率低的问题，而提供了一种多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法。

本发明的一种多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳方法，是按照以下步骤进行的：

一、利用微卫星分子标记对不同群体或群体中不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，得待检测扩增产物；

二、制备同样面积的两块3%的琼脂糖凝胶，取其中一块3%的琼脂糖凝胶作为下层琼脂糖凝胶，另一块3%的琼脂糖凝胶平行放置在下层琼脂糖凝胶上，作为上层琼脂糖凝胶，将下层琼脂糖凝胶与上层琼脂糖凝胶放入电泳缓冲液中，备用；

三、取步骤一中待检测扩增产物在下层琼脂糖凝胶上样后，进行电泳，待扩增产物与点样孔距离为1~2cm时，切断电源，停止电泳；

四、在下层琼脂糖凝胶的凝胶孔继续上样，接通电源，继续进行电泳，待扩增产物与点样孔距离为1~2cm时，切断电源，停止电泳；然后在上层琼脂糖凝胶上样，接通电源，继续进行电泳，待扩增产物与点样孔距离为1~2cm时，切断电源，停止电泳；

五、重复步骤四的操作，直至待检测的扩增产物跑到凝胶底部时，切断电源，停止电泳；

六、采用紫外凝胶成像系统对电泳结果进行检测，即完成多重点样、双层电泳检测微卫星DNA的琼脂糖凝胶电泳。

本发明包含以下有益效果：

本发明快速、高效的琼脂糖电泳方法主要内容包括琼脂糖凝胶制备、双层电泳、分次成像，本发明是利用琼脂糖凝胶的亲水性、理化结构的稳定性、分辨率高而形成的一种新的电泳检测方法，对植物并无特异性，可以分离任何植物的目标分子标记，具有广泛的适用性。

1、本发明克服了国内实验室琼脂糖凝胶电泳中，单次点样造成的试剂药品过度浪费、染色剂对人体的危害、及凝胶和电泳缓冲液等废弃物对环境造成极大污染的缺点，极大提高了琼脂糖凝胶和电泳缓冲液的利用率，节约了人力和成本。本发明通过对PCR产物片段大小、EB浓度及多重点样间隔距离等重要环节的摸索实现了多重点样，与单次点样比较，不需要重新制备凝胶，10cm长的一块凝胶可重复点样8次，节省成本8倍以上。