[发明专利]一种定点突变的耐高温植酸酶基因TP及其表达载体和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学饲料添加剂领域，具体涉及一种定点突变的耐高温植酸酶基因TP及其表达载体和应用。

背景技术

植酸(肌醇六磷酸)是植物中磷的主要储存形式，植酸及其盐类是谷物、豆类及油料等作物中磷的主要贮存形式。由于单胃动物的胃内缺乏相应的酶而不能水解利用植酸，这造成了磷源的浪费，而且不能被利用的植酸中的磷被直接排出体外，造成了土壤及水域的磷污染。另外，植酸还能与矿质元素及蛋白质螯合，使这些营养元素不能被有效利用，导致了植物性饲料营养价值的降低，因此植酸也被普遍认为是饲料中的一种抗营养因子。

植酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，目前实际应用的植酸酶均来源于微生物。天然微生物中植酸酶含量太低，难以大量获得廉价的植酸酶产品，不能满足饲料工业发展的要求。目前利用基因工程菌来获得高表达量的植酸酶，对植酸酶的广泛应用及降低生产成本发挥了重要作用。目前已经有多种微生物来源的植酸酶基因得到分离，如黑曲霉、芽孢杆菌、大肠杆菌等。根据研究对比，来源于大肠杆菌的植酸酶(appA植酸酶)是迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶。1985年首次克隆出了大肠杆菌植酸酶编码基因appA；1990年对该基因进行了序列分析；1992年通过定点突变的方法实现了appA基因的过量表达。目前，植酸酶制剂在应用上的一个关键问题即酶的热稳定性始终没有得到很好地解决，制粒高温对植酸酶酶活产生极大的破坏，虽然研究者已从不同的方面对植酸酶的耐热性进行了许多富有成效的研究，如通过筛选产耐热植酸酶的菌株、运用蛋白质工程、改进生产工艺等方法来获得耐热植酸酶，但是获得的植酸酶耐热效果仍然不理想。

发明内容

本发明提供了一种定点突变的耐高温植酸酶基因TP及其表达载体和应用，本发明通过定点突变大肠杆菌的植酸酶(appA植酸酶)氨基酸序列，来提高植酸酶的热稳定性，并按照毕赤酵母密码子偏好性改造其基因，以获得植酸酶突变体的高效表达。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了一种定点突变的耐高温植酸酶基因TP，其碱基序列如SEQ ID No：4所示；所述对应的耐高温植酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID No：5所示。

本发明还提供了含有所述的耐高温植酸酶基因TP的载体，具体所述载体为pPIC9K-TP。

本发明提供了所述的耐高温植酸酶在作为饲料添加剂中的应用，所述耐高温植酸酶的用量为100-200克/吨饲料。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：为提高植酸酶热稳定性，本发明选择了迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶-大肠杆菌植酸酶(appA植酸酶)，先将植酸酶氨基酸序列中特定区域的氨基酸突变成脯氨酸(P)和精氨酸(R)，使植酸酶具有特殊的稳定蛋白质结构，后将植酸酶氨基酸序列反方向翻译获得基因序列，在对植酸酶氨基酸序列的部分区域进行定点突变的同时对其基因序列按毕赤酵母菌密码子偏好性、GC含量对其基因序列进行优化，同时按照毕赤酵母密码子偏好性人工合成植酸酶基因后，将其克隆到真核载体pPIC9K中，构建了重组质粒pPIC9K-TP。将重组质粒pPIC9K-TP线性化后经电击转化法转到毕赤酵母GS115中，将筛选获得阳性转化子进行诱导表达获得耐高温且表达量高的植酸酶。用分光光度法检测植酸酶的酶活性，并在不同反应温度条件下检测植酸酶的酶活比率。经实验证明，由毕赤酵母表达后获得的植酸酶可以耐受85℃以上的高温制粒，存留率达到85％。

本发明通过改造氨基酸序列获得的植酸酶突变体具有很好的耐热性，在毕赤酵母中获得高表达量。这种植酸酶的推广应用，不仅对我国饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生巨大的生态效益。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是本发明中重组质粒pUC18-T-TP的PCR鉴定电泳图谱，M表示DL2000 DNA marker；1表示质粒pUC18-T-TP的PCR产物。

图2是本发明中重组表达质粒pPIC9K-TP的PCR鉴定电泳图谱，M表示DL2000 DNA marker；1表示质粒pPIC9K-TP的PCR产物。

图3是本发明中植酸酶突变体蛋白SDS-PAGE的凝胶图谱，图中M表示蛋白MW Marker；1表示重组菌株GS115/pPIC9K-TP表达上清；2表示重组菌株GS115/pPIC9K诱导上清。

图4是本发明中改造后植酸酶在不同反应温度条件下植酸酶酶活图。