[发明专利]通过敲除基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过敲除yvoA基因提高苏云金芽胞杆菌几丁质酶产量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性菌，其在生长周期的稳定期形成的芽胞及伴胞晶体使其独具特性。由于苏云金芽胞杆菌制剂对靶标昆虫有特异性毒杀作用，且对人畜安全、不危害环境，在农业、林业和卫生害虫的防治上得到了广泛应用。

许多Bt菌除了合成杀虫晶体蛋白外，也能产生几丁质酶。Bt几丁质酶不仅具有杀虫增效作用，对病原真菌也有抑制作用，具有防治农作物病虫害的作用（Liu D,Cai J,Xie CC,Liu C,Chen YH.Purification and partial characterization of a 36-kDa chitinase from Bacillus thuringiensis subsp.colmeri,and its biocontrol potential.Enzyme and Microbial Technology,2010,252–256.Xiao L,Xie CC,Cai J,Lin ZJ,Chen YH.Identification and characterization of a chitinase-produced Bacillus showing significant antifungal activity.Current Microbiology,2009,58(5):528–533.）。此外，由几丁质酶分解产生的几丁寡糖有明显的抗肿瘤作用，可激活巨噬细胞和淋巴细胞,增强机体免疫力,已用于抗癌的临床治疗以及药物及保健食品的开发领域（Khoushab F,Yamabhai M.Chitin research revisited.Marine Drugs,2010,8(7):1988–2012.；Zhao Y,Park RD,Muzzarelli RAA.Chitin deacetylases:properties and applications.Marine Drugs,2010,8(1):24-46.；Zhou Z,Zheng T,Homer R J,Kim Y,Chen N Y,Cohn L,Hamid Q and Elias J A.Acidic Mammalian Chitinase in AsthmaticTh2 Inflammation and IL-13Pathway Activation.Science,2004,304:1678~1682.）。因此几丁质酶在农业、工业、食品、医药等领域展现出良好前景，具有重要的经济价值。但由于Bt菌株几丁质酶产量普遍较低，制约了其在实际生产中的应用。因此，提高Bt几丁质酶产量是几丁质酶开发应用的关键问题之一。

目前，国内外提高Bt 几丁质酶产量的方法主要是筛选高产菌株，优化发酵条件，而甚少应用分子生物学技术对菌株进行改良来提高其产量。

YvoA蛋白（Gene ID:JQ579452），作为芽孢杆菌中的一种调控蛋白，在N-乙酰葡糖胺的代谢过程中发挥着关键的作用，相关研究表明，YvoA蛋白对几丁质酶的合成具有一定的阻遏作用。

发明内容

本发明的目的是解决现有Bt菌株几丁质酶产量普遍较低的问题，提供一种通过敲除基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌的方法及应用。

本方法利用分子生物学技术，首先以温度敏感型载体pKSV7为骨架构建一个基因敲除载体pKSV-ued，经过电转化导入苏云金芽胞杆菌ATCC35646菌株中。利用同源重组原理，通过双交换过程敲除苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组yvoA基因，从而构建一种高产几丁质酶的苏云金芽胞杆菌CJ212（见图1）。

本发明提供的通过敲除yvoA基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）CJ212的方法包括：

第1、yvoA基因敲除载体pKSV-ued的构建（见图2）

第1.1、设计序列表中SEQ ID No.1所示的引物yvoAup-F和SEQ ID No.2所示的引物yvoAup-R，以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因上游序列，获得1059bp的yvoAup核酸片断；