[发明专利]利用固定化酶合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物技术领域，具体地说，涉及利用固定化酶促合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。

背景技术：

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，缩写NAD)，也称氧化型辅酶I。是一种转递质子(更准确来说是氢离子)的辅酶，它出现在细胞很多代谢反应中。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种基本的氧化还原辅酶，不论是在呼吸作用还是光合作用过程，它都起着核心枢纽作用。另外，NADH不能直接为分子态氧所氧化，但能通过NADH脱氢酶的作用进行脱氢变成NAD。在呼吸链中，通过这种作用，可使黄素、醌、细胞色素等逐步被还原，最后氧被还原成水。这种以NAD为媒介的底物被O₂所氧化的途径，是好氧生物的主要有机物的氧化途径。

目前，工业界、医药界或作为生化试剂使用的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)基本上是通过酵母菌发酵而来。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种利用固定化酶促合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。本发明的另一目的还在于提供含有编码本发明所述的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(nicotinamide-nucleotide adenylyltransferase)的基因序列。本发明的再一目的在于利用固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶催化，以烟酰胺核苷酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

为实现本发明的上述目的，本发明人进行了大量深入的实验，通过克隆较佳的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶基因至适当的载体，转入大肠杆菌后，无须诱导，本发明的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶在大肠杆菌中皆高表达。通过将表达的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶提取并固定于适当的环氧型酶载体，从而获得了高活力的固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶，该固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶能以烟酰胺核苷酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

本发明的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶是来源于Methanocaldococcusjannaschii DSM 2661。序列表中的SEQ ID NO.：2代表本发明的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的氨基酸序列。

本发明的酶固定化载体是选择了环氧型载体LX-3000，还可选用本领域的其它酶固定化载体，如传统的无机载体材料二氧化硅、活性炭、玻璃珠等，再如有机高分子载体大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯等。通过与该类型载体结合，本发明获得了高活力的固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶，该酶以烟酰胺核苷酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物，高转化率(大于80％)生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

附图的简要说明：

图1：重组的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(粗提蛋白)之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，图中右边条带并配有数字(单位是“KD”)是蛋白分子量标准，具体参见实施例2。

具体实施方式：

利用本领域已知的技术，先构建含有编码烟酰胺核苷腺苷酰转移酶基因的载体质粒，然后转入大肠杆菌后，无须诱导培养，将表达的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶提取并固定于适当的环氧型酶载体，从而获得高活力的固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶。用固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶催化，以烟酰胺核苷酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

本发明所获得的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞胞外表达。

在本发明制备烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的方法中，所述载体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述原核细胞包括但不限于大肠杆菌(如HB101，BL21，JM109，DH5a)、枯草芽胞杆菌和链霉菌。所述真核细胞包括但不限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母(如毕赤巴斯德酵母GS115)。

本发明用于克隆烟酰胺核苷腺苷酰转移酶基因的载体包括但不限于pRSET系列、pGEM-T系列等。

本发明烟酰胺核苷腺苷酰转移酶之国际酶学委员会命名编号为EC2.7.7.1。

本发明用于固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的载体包括但不限于环氧型载体等。

在本申请文本中所用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.，138：9-37，1984)。

下列实施例仅用于说明本发明而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。

实施例1：烟酰胺核苷腺苷酰转移酶编码基因的扩增与克隆