[发明专利]卵转铁蛋白的分离提取的方法

说明书

技术领域

本发明涉及有机化合物提取领域技术领域，特别是涉及一种卵转铁蛋白的分离提取的方法。

背景技术

卵转铁蛋白又称为副卵白蛋白或者卵伴白蛋白，是禽蛋清中的一种含686个氨基酸残基的单亚基糖蛋白，约占蛋清蛋白的10-13%左右，分子质量为77-80ku，其pI值为6.0-6.7。卵转铁蛋白具可逆性结合三价铁离子的能力以及转铁的功能，还具有抑菌功能、抗病毒功能、调节生理功能以及抑制自由基生成等作用，在制药工业和食品工业极具广泛的应用前景。

目前国内外用于提取制备卵转铁蛋白方法有盐沉淀法、膜分离技术法、阴阳离子树脂交换法、固定化金属螯合亲和色谱法等。1948年Bain和Deutsch以及1951年的Warner和Weber利用水相和乙醇相分级分离法提取该蛋白，1954年Warner以及1967年Azari和Baugh利用硫酸铵的分级沉淀以及絮凝沉淀分离出了卵转铁蛋白。但上述方法容易造成卵转铁蛋白的变性，并且产品的纯度较低。后来作为方法的改进，很多研究者采用了色谱法，如离子交换层析、亲和色谱以及凝胶过滤色谱分离并纯化卵转铁蛋白：1958年Rhodes等人以及1967年Azari和Baugh利用羧甲基纤维素阳离子交换色谱，1960年Mandeles利用DEAE纤维素阴离子交换色谱，1995年Vachier等人利用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱,1992年Guerin和Brule利用Duolite C464和C476阳离子交换色谱用于工业制备卵转铁蛋白，1987年Al-Mashikhi和Nakai利用固定化金属亲和色谱法（铜离子Sepharose 6B）一步法制备卵转铁蛋白，1991年Chung等人利用双功能DEAE胶蓝亲和色谱分离该蛋白，1994年Awade等人利用Q-Superose Fast Flow阴离子交换色谱以及Superose-6制备级凝胶过滤色谱柱两步法分离纯化卵转铁蛋白。这些色谱分离方法在一定程度上为提取分离卵转铁蛋白提供了一定的方法，但是这些方法中有些虽然能使产品的纯度达到较高的水平，但其制备的规模很小，不适于工业化生产，特别是利用凝胶过滤色谱技术的方法，并且；有些制备出的产品纯度较低。而且这些方法制备成本较高，特别是所用的制备介质，很难扩大成为工业制备的方法。2008年K.Y.Ko和D.U.Ahn利用碱性条件下（pH=9.0）并有伴阴离子（HCO₃^-）的存在下，卵转铁蛋白可通过HCO₃^-与Fe³⁺形成三元复合体，即Fe³⁺₂-HCO₃^--卵转铁蛋白复合物，该复合物形成后整个蛋白分子结构变得更紧密、封闭、稳定，并且提高了其对乙醇沉淀作用的耐受性，因此先让卵转铁蛋白在碱性条件下生成复合物，然后再通过醇析法提取分离得到卵转铁蛋白，该法制备规模具有放大成工业级规模的可能，但是其产品纯度只有80%。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种产品的纯度高，方法简单，能够实现工业化生产的卵转铁蛋白的分离提取的方法。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

一种卵转铁蛋白的分离提取的方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）将无粘蛋白蛋清溶液的pH值调节至7.5-9.0，采用乙醇析出法提取得到卵转铁蛋白粗品；

（2）利用两步弱酸性阳离子交换层析法纯化上述卵转铁蛋白粗品，纯化的卵转铁蛋白在1-10℃条件下经透析除盐得到高纯度的卵转铁蛋白。

所述无粘蛋白蛋清溶液通过下述方法制备：将新鲜蛋清中加入三倍体积的去离子水或pH值为5.0-6.0缓冲液稀释，过滤除去不溶性物质，并调节所得滤液的pH值至5.0-6.0，在1-10℃低速搅拌过夜，然后在1-10℃、2500-5000×g离心5-20min，除去蛋清溶液中的粘性蛋白，减低溶液的粘度，便于以后的操作，离心获取的上清液即为无粘蛋白蛋清溶液。上述低速搅拌的速度选择10-30rpm。所得滤液的pH值可以使用1.00mol/L的HCl溶液进行调节。

所述乙醇析出法提取卵转铁蛋白粗品的步骤如下：